Comprendere le cellule di Islet di Donor e il loro ruolo clinico

Per i pazienti che vivono con diabete di tipo 1, la perdita di cellule beta che producono insulina trasforma una funzione biologica di routine in un calcolo medico costante. I livelli di glucosio nel sangue che si alzano o cadono pericolosamente possono portare a complicazioni che vanno dalla neuropatia al coma. Mentre la terapia insulinica esogenea del destinatario rimane lo standard di cura, non può replicare la reattività in tempo reale di un pancreas sano.

Cosa sono le celle di donatore?

Il pancreas, organo lungo circa sei pollici situato dietro lo stomaco, svolge due lavori distinti. Il suo tessuto esocrino produce enzimi digestivi, mentre il suo tessuto endocrino - gli isolotti di Langerhans - produce ormoni che regolano il metabolismo. Nonostante rappresentino solo 1 a 2 per cento della massa pancreatica totale, le isolotti sono densamente confezionate con cellule specializzate che lavorano in concerto per mantenere la mitosi di glucosio.

Ogni isolotto è un micro-organ contenente diversi tipi di celle con funzioni distinte:

  • Le cellule beta] costituiscono il 50-70 per cento delle cellule di isolotto e sono l'unica fonte di insulina nel corpo. Sentono i livelli di glucosio nel sangue e rilasciano l'insulina in un modello bifasico: una prima fase rapida entro i minuti di un pasto, seguita da una seconda fase sostenuta che continua fino a quando il glucosio ritorna alla linea di base.
  • Le cellule di Alfa] producono il glucagone, l'ormone contro-regolatorio che solleva il glucosio nel sangue stimolando la ripartizione del glicogeno nel fegato. La funzione sana delle cellule alfa è essenziale per prevenire l'ipoglicemia.
  • Le cellule di delta[] secrete somatostatin, che agisce localmente per modulare il rilascio di insulina e glucagone, fornendo una fine-tuning all'interno del microambiente di isolotto.
  • Le cellule di PP[] producono polipeptide pancreatico, un ormone coinvolto nella regolazione dell'appetito e nella funzione digestiva.

Nel diabete di tipo 1, il sistema immunitario identifica erroneamente le cellule beta come estranee e li distrugge attraverso una combinazione di autoanticorpi e cellule di T citotossiche. Una volta che l'80% delle cellule beta sono perse, la regolazione del glucosio nel sangue non riesce a. I pazienti diventano dipendenti da insulina fluente esogena per la sopravvivenza.

Il processo di isolamento dell'isolazione dell'isola

Trapiantare un intero pancreas è un'opzione, ma è una procedura chirurgica importante con rischi significativi. Il trapianto di isolotto, al contrario, è un infuso minimalmente invasivo. Tuttavia, l'estrazione di isolotti dal pancreas è un processo tecnicomente impegnativo che deve essere completato sotto vincoli di tempo stringenti.

La procedura inizia con pancreas recovery[]. Il pancreas donatore viene rimosso chirurgicamente e trasportato in una struttura di isolamento certificato isolotto. Il tempo di ischemia freddo – il tempo tra il recupero e l'isolamento degli organi – deve essere mantenuto sotto 8-10 ore per mantenere la vitalità dell'isolotto.

Nella struttura di isolamento, il pancreas subisce digestione enzimatica. La collagene e la proteasi neutrale sono infusi attraverso il condotto pancreatico per abbattere la matrice extracellulare che tiene gli isolotti all'interno del tessuto esocrino. Questa digestione è accuratamente monitorata sotto un microscopio; se procede troppo, i 30 minuti sono danneggiati, ma

Il digerimento risultante contiene una miscela di isolotti, cellule esocrine e detriti. La pigmentazione è ottenuta utilizzando la centrifugazione a tasso variabile. Il digerire è stratificato su un gradiente di densità di purificazione variabile (tipicamente usando Ficoll o iodixanol) e si estende ad alta velocità.

Dopo la purificazione, la preparazione dell'isolotto subisce una rigorosa valutazione della qualità]]. I tecnici contano gli isolotti e convertono il conteggio agli equivalenti dell'isolotto (IEQ), un'unità standardizzata che normalizza le dimensioni dell'isolotto. La visibilità viene valutata utilizzando coloranti fluorescenti che distinguono dal vivo dalle cellule morte; è generalmente richiesto un trapianto di almeno il 70%.

L'intero processo di recupero del pancreas al rilascio finale del prodotto richiede 6-12 ore, e il prodotto finale è una sospensione cellulare contenente 250.000 a 1,000,000 IEQ, a seconda delle caratteristiche del donatore e dell'efficienza dell'isolamento.

Il processo di corrispondenza critica

L'innesto di donatore corrisponde a una valutazione di compatibilità multistrato che differisce significativamente dal trapianto di organi solidi. Poiché gli isolotti vengono trapiantati come innesto cellulare, il sistema immunitario li incontra in un contesto unico. Il fegato, dove gli isolotti sono tipicamente infusi, è un organo immunologicomente attivo, e l'interazione immediata tra le cellule donatorie e le cellule immunitarie del destinatario può determinare se l'innesto sopravvive o è la perdita rapida di se viene distrutta.

Compatibilità con il tipo di sangue ABO

I centri di certificazione di tipo Oesi possono essere utilizzati solo per il trapianto di tipo A, mentre i centri di compatibilità analogici di tipo A e tipo Opressup sono i seguenti:

HLA Matching

Il sistema antigene umano del leucocito (HLA) è il secondo fattore di compatibilità importante. Le molecole HLA sono proteine della superficie cellulare che presentano frammenti antigeni alle cellule T, consentendo al sistema immunitario di distinguere se stessi da non sé. I loci chiave sono HLA-A, HLA-B e HLA-DR. Ogni persona eredita due copie di ogni gene (uno da ogni genitore), che possono essere sei antigeni.

I dati del Registro di Islet Collaborative Transplant Registry (CITR) mostrano che un numero più elevato di HLA corrisponde a un migliore tasso di indipendenza dell'insulina. Tuttavia, l'HLA corrispondente nel trapianto di isolotto è meno rigoroso rispetto a quello del trapianto di rene o di midollo osseo molti farmaci richiedono un'immunoptazione moderata.

Il sistema di controllo dell'isolamento isolotto è già estremamente limitato. Richiedere una perfetta corrispondenza HLA escluderebbe la maggior parte dei potenziali destinatari e non sarebbe necessariamente migliorare i risultati sufficienti per giustificare l'aumento del tempo di attesa. L'obiettivo è quello di colpire un equilibrio che minimizza il rischio di rifiuto, massimizzando l'accesso al trapianto.

Donor-Recipient Size Abbinamento

La dose di isolotto è espressa come equivalente di isolotto per chilogrammo di peso corporeo ([IEQ/kg[]]). La dose di destinazione per ottenere l'indipendenza dell'insulina è di almeno 5.000 IEQ/kg, sebbene alcuni centri mirano a 10.000 IEQ/kg o più.

Le caratteristiche del donatore che influenzano il rendimento dell'islet includono l'età, l'indice di massa corporea (BMI) e la salute del pancreas. I donatori di età compresa tra i 20 e i 50 anni tendono a produrre il maggior numero di isolotti. Quelli con un BMI nella gamma di sovrappeso (25-30) hanno spesso dei pancreas più grandi con una massa di isolotti, ma i donatori con l'obesità essenziale (BMI su 35) sono associati con una funzione di minore funzione di ispastazione ridotta e un rischio di infiltrazione di insufficienza di ingrasso.

Sensitizzazione sensibile

I pazienti che hanno avuto trapianti precedenti, trasfusioni di sangue o gravidanze possono avere anticorpi anti-HLA preformati. Questi anticorpi sono rilevati attraverso un test anticorpo reattivo (PRA) del pannello, che misura la percentuale di un pannello standard di antigeni donatori che gli anticorpi del destinatario reagiscono contro. Un paziente altamente sensibilizzato (PRA sopra l'80%) ha anticorpi compatibili con un'ampia gamma di H

Per i destinatari sensibili, il processo di corrispondenza diventa più complesso. Il team di trapianto deve identificare gli specifici antigeni HLA che il destinatario ha anticorpi contro ed esclude i donatori che trasportano quegli antigeni.

Fattori di corrispondenza aggiuntivi

Oltre ai fattori di compatibilità del nucleo, diverse altre considerazioni influenzano la decisione corrispondente:

  • L'urgenza del bisogno[ – I pazienti con diabete fragile, ipoglicemia grave ricorrente, o ipoglicemia non consapevolezza sono prioritari.
  • Tempo di attesa[[] – I sistemi di allocazione considerano quanto tempo un paziente è stato nella lista di attesa, con più lunghe attese crescente priorità.
  • La vicinanza geografica[ – Il tempo dell'ischemia fredda dell'isola è limitato a 8-10 ore. Il donatore e il destinatario devono essere a distanza che consente il trasporto delle isolotte isolate al centro di trapianto all'interno di questa finestra.
  • screening salute del donatore[ – I donatori sono testati per malattie infettive (HIV, epatite B e C, citomegalovirus, virus Epstein-Barr), infezioni attive, rischio di cancro e condizioni metaboliche.

Immunosuppressione e prevenzione di iniezione

Anche con un'ottima corrispondenza, il sistema immunitario del destinatario riconoscerà gli isolotti donatori come stranieri. Prevenire il rifiuto richiede l'immunosoppressione per tutta la vita, e il regime usato nel trapianto di isolotto differisce da quello utilizzato per gli organi solidi. Le caratteristiche uniche di innesti di isolotto - sono cellulari piuttosto che vascolarizzati, sono infusi nella vena del portale, e sono suscettibili sia al contempo al contempo al riparommune-demmunitario-

Il Protocollo di Edmonton

Prima del 2000, il trapianto di isolotti ebbe un successo limitato, con solo circa il 10 per cento dei destinatari che raggiungevano l'indipendenza dell'insulina. Ciò cambiò con l'introduzione del Protocollo di Edmonton all'Università di Alberta. Questo regime unito un protocollo immunosoppresso privo di steroidi con un'attenta selezione del paziente e preparati di isolotto di alta qualità.

  • Sirolimus (rapamicina)[ – Un inibitore mTOR che blocca la proliferazione delle cellule T interferendo con la segnalazione interleukin-2.
  • Tacrolimus[ – Un inibitore di una neuronina che sopprime la produzione di citochina nelle cellule T.
  • Daclizumab[[] – Un anticorpo monoclonale contro la catena alfa del recettore IL-2, usato come terapia di induzione per esaurire le cellule T attivate al momento del trapianto.

Il protocollo Edmonton ha raggiunto l'indipendenza dell'insulina in oltre l'80% dei destinatari ad un anno, un miglioramento drammatico. Tuttavia, il follow-up a lungo termine ha rivelato sfide: la funzione di isolotto è diminuita nel tempo, e molti pazienti hanno sperimentato effetti collaterali dai farmaci immunosoppressori, tra cui ulcere della bocca, diarrea, edema e nefrotossicità.

Evasione immunitaria e incapsulamento

La necessità di immunosoppressione per tutta la vita è una barriera importante per l'adozione più ampia del trapianto di isolotto. I farmaci aumentano il rischio di infezione, malignità e tossicità degli organi, e sono scarsamente tollerati da alcuni pazienti. I ricercatori hanno cercato a lungo modi per proteggere gli isolotti dal sistema immunitario senza immunosoppressione sistemica.

Il principio è semplice: racchiudere isolotti in una membrana semipermeabile che permette al glucosio e all'insulina di passare liberamente ma blocca le cellule immunitarie e gli anticorpi di grandi dimensioni.

  • Macroencapsulation[[] – Un dispositivo più grande, spesso simile a una busta piana o un disco, che può essere posizionato sotto la pelle o nella cavità peritoneale. Il dispositivo ospita migliaia di isolotti ed è progettato per essere rivivente se necessario. Il dispositivo di macroencapsulazione più avanzato, da ViaCyte (ora parte delle cellule di test cliniche
  • Microencapsulation[[] – Ogni isolotto è rivestito individualmente in uno strato sottile di alginato, un polimero biocompatibile derivato dall'alga marina. I microcapsulli (tipicamente 300-500 micrometri di diametro) forniscono un elevato rapporto superficie-volume per una diffusione efficiente.
  • Incapsulamento a strati di strati di polimeri caricati[ – Rivestimenti su scala Nano applicati alla superficie dell'isolotto utilizzando strati alternati di polimeri caricati. Questo approccio consente un controllo preciso sullo spessore e sulla permeabilità del rivestimento e riduce al minimo la distanza di diffusione.

Le principali sfide che si trovano ad affrontare l'incapsulamento sono l'offerta di ossigeno, la fibrosi (la risposta del corpo estero che ricopre la capsula con il tessuto cicatriziale), e la durata del materiale di rivestimento. Islets hanno un'alta domanda metabolica e richiedono concentrazioni di ossigeno più alte di quelle riscontrate nella maggior parte dei siti di impianto.

Sfide Limitare l'applicazione più ampia

Nonostante i successi del trapianto di isolotti, il campo affronta ostacoli sostanziali che impediscono di diventare un trattamento mainstream per il diabete di tipo 1, e capire queste sfide è essenziale per apprezzare dove si sta dirigendo la ricerca.

Dono Shortage

Negli Stati Uniti, circa 1,5 milioni di persone vivono con diabete di tipo 1, ma meno di 2.000 donatori deceduti all'anno sono adatti per l'isolamento dell'isolotto. Molti pancreas sono scartati perché il donatore è troppo giovane (sotto 10 anni) o troppo vecchio (oltre 60), ha un alto trapianto di BMI, ha prolungato il tempo di ischemia, o ha problemi di salute sottostanti come il pancreati

Questa carenza ha spinto gli sforzi a trovare fonti alternative di cellule, se si potesse produrre un approvvigionamento illimitato di cellule isolotte funzionali, la carenza di donatori sarebbe diventata una nota storica piuttosto che un vincolo definito.

Durata del fusto a lungo termine

Anche quando il trapianto riesce, la funzione isolotto tende a diminuire nel tempo. I dati del Registro di Islet Collaborativo Transplant indicano che il 50-70 per cento dei destinatari rimangono insulin-dipendenti ad un anno, ma che il numero scende al 30-50 per cento a cinque anni.

I fattori alloimmuni cronici possono verificarsi anche con immunosoppressione. L'autoimmunità ricorrente può colpire le cellule beta trapiantate. Immunosuppressive droghe, in particolare gli inibitori di calcineurina come il tattolimo, hanno effetti tossici diretti sulle cellule beta e possono compromettere la secrezione dell'insulina. L'alta domanda metabolica posta su una massa di isolotto limitata può portare a esaurimento della durata epausa epausa.

Le direzioni e le tecnologie emergenti

Diversi linee convergenti di ricerca promettono di superare i limiti del trapianto di isolotto donatore e potenzialmente trasformare il trattamento del diabete di tipo 1.

Islets sterilizzati a celle

Nel 2014, i ricercatori dell'Università di Harvard, guidati da Douglas Melton, hanno pubblicato uno studio di riferimento che mostra che le cellule staminali embrionali umane potrebbero essere guidate attraverso una serie di passaggi di differenziazione per diventare cellule beta funzionali che hanno secreto l'insulina in risposta al glucosio. Il protocollo ha riepilogato le normali fasi di sviluppo della formazione pancreatica marcante, con conseguente vizione delle cellule che hanno espresso chiave.

Da allora, diverse aziende hanno avanzato isolotti derivati dalla cellula staminale verso l'uso clinico. Vertex Pharmaceuticals ha avviato studi clinici con VX-880, un prodotto derivato da cellule staminali allogeneiche che si differenziano in cellule isolotte completamente mature. I primi risultati sono stati notevoli: il primo paziente ha trattato l'indipendenza dell'insulina dopo un'unica infusione, con la produzione robusta del C-peptide e un eccellente controllo glicemico.

Vertex sta sviluppando anche VX-264, che combina isolotti derivati da cellule staminali con un dispositivo di incapsulamento per eliminare la necessità di immunosoppressione. Questo prodotto è in precedenti fasi sperimentazioni cliniche. Se di successo, potrebbe rappresentare una terapia trasformativa disponibile a qualsiasi paziente con diabete di tipo 1, indipendentemente dalla disponibilità del donatore.

I vantaggi delle isolotti derivate dalle cellule staminali sono significativi, possono essere prodotti in quantità illimitate con qualità costante, possono essere progettati per ridurre o eliminare l'immunogenicità e possono essere standardizzati per garantire che ogni dose contenga un numero definito di cellule funzionali. La sfida rimane dimostrando sicurezza ed efficacia a lungo termine, in particolare riguardo al rischio di formazione teratoma (da cellule indifferenziate residue) e alla durata della funzione.

Gene Editing e celle di donazione universali

CRISPR-Cas9 e altri strumenti di eliminazione genica sono applicati sia agli isolotti donatori che agli isolotti derivati dalle cellule staminali per ridurre l'immunogenicità. L'obiettivo è quello di creare cellule donatori universali che possono essere trapiantate in qualsiasi destinatario senza causare una risposta immunitaria.

  • Knockout delle molecole HLA[[] – Eliminando le molecole della classe HLA I e della classe II, impedisce il riconoscimento delle cellule T. Tuttavia, questo rende anche le cellule vulnerabili alle cellule killer naturali (NK), che riconoscono le cellule che mancano di HLA.
  • Espressione delle molecole di occultamento immunitarie[ – CD47, una proteina di superficie cellulare che segnala "non mangiarmi" ai macrofagi, può essere sovraespressa per proteggere l'innesto dalla distruzione immunitaria innata.
  • Inserzione dei transgenes protettivi[[] – I geni che conferiscono resistenza ai citochine infiammatori (come l'antagonista del recettore IL-1 o le proteine antiapoptotiche) possono essere introdotti per aiutare gli isolotti a sopravvivere all'ambiente di trapianto ostile.
  • I isolotti ipoimmuni[[] – Alcuni gruppi hanno isolotti ingegnerizzati che contemporaneamente espongono la classe I e II di HLA, esprimono HLA-E (che inibisce le cellule NK), e sovraesprimere CD47. Nei modelli animali, queste isolotti ipoimmuni sopravvivono per mesi senza immunosoppressione.

La combinazione di tecnologia delle cellule staminali e modifica del gene mantiene la promessa di creare isolotti donatori universali fuori dal suo scaffale che possono essere trapiantati in qualsiasi paziente senza rifiuto, eliminando sia la carenza di donatori che la necessità di immunosoppressione, risolvendo i due problemi più grandi del campo.

Siti alternativi di trapianto

Il fegato è stato il sito standard per l'infusione di isolotti dallo sviluppo del protocollo di Edmonton. La vena del portale è accessibile tramite una procedura di catetere minimamente invasiva, e il fegato fornisce un ambiente di supporto per l'incisione di isolotti. Tuttavia, il fegato è lontano dall'ideale. La tensione di ossigeno nei sinusoidi del fegato è relativamente bassa, che può contribuire a ipossia di isolotto e la morte cellulare.

I ricercatori stanno esplorando siti di trapianto alternativi che potrebbero fornire condizioni migliori per la sopravvivenza e la funzione dell'isolotto:

  • L'omentum[ – L'omentum, una membrana grassa nell'addome, è emerso come candidato leader. E 'molto vascolarizzato, può essere accessibile laparoscopiaticamente, e permette di retrival se necessario.
  • Lo spazio sottocutaneo[[] – L'impianto sottocutaneo è l'opzione meno invasiva, ma il sito ha un'alimentazione limitata e si basa sulla fibrosi. I ricercatori stanno sviluppando approcci per prevascolare il sito utilizzando fattori di crescita o impianti temporanei prima del trapianto di isolotto.
  • La camera anteriore dell'occhio – La camera anteriore dell'occhio è un sito privato immune con alta tensione di ossigeno e un facile monitoraggio visivo dell'innesto. Islets trapiantati nella camera anteriore possono essere osservati non invasivamente utilizzando la microscopia, fornendo una finestra in funzione di innesto. Questo approccio è ancora sperimentale ma offre vantaggi clinici unici per la ricerca e potenzialmente.
  • Midollo di ossa[[] – Il midollo osseo è un altro sito privato del sistema immunitario che è stato utilizzato sperimentalmente.

Il sito ideale di trapianto fornisce un'elevata tensione di ossigeno, un facile accesso per l'impianto e il monitoraggio, la protezione dall'attacco immunitario e la capacità di recuperare l'innesto se necessario.

Risultati clinici e quali pazienti possono aspettarsi

Per i pazienti che considerano il trapianto di isolotto, le aspettative realistiche sono essenziali. La procedura non cura il diabete di tipo 1, ma può migliorare drasticamente il controllo glicemico e la qualità della vita. I migliori risultati sono visti in pazienti che ricevono una dose di isolotto adeguata (almeno 5.000 IEQ/kg), hanno un buon HLA corrispondenza e aderiscono al loro regime immunosoppressore.

Anche nei pazienti che non raggiungono la completa indipendenza dell'insulina, la maggior parte sperimenta una significativa riduzione della frequenza e della gravità dell'ipoglicemia. I livelli di emoglobina glicata (HbA1c) in genere migliorano, e i pazienti segnalano una migliore qualità della vita, una minore distress legata al diabete e una maggiore libertà nelle attività quotidiane.

Tuttavia, il trapianto di isolotto non è senza rischi. La procedura di infusione può causare sanguinamento, trombosi della vena del portale e l'elevazione degli enzimi epatici. Immunosuppression comporta rischi di infezione, malignità e effetti collaterali specifici della droga. E la durata a lungo termine dell'innesto rimane limitata, con la maggior parte dei pazienti eventualmente assumendo un certo uso di insulina.

Conclusioni

Il trapianto di cellule di Donor islet rappresenta uno dei più significativi progressi nel trattamento del diabete di tipo 1 negli ultimi due decenni. La procedura ha ripristinato l'indipendenza dell'insulina e ha migliorato drasticamente la vita di migliaia di pazienti. Il processo di corrispondenza - il tipo di sangue di accompagnamento, la compatibilità HLA, la dose di isolotto e la sensibilizzazione del destinatario - è un sistema accuratamente calibrato progettato per massimizzare la sopravvivenza dell'innesto entro i vincoli di una riduzione della vita di un ripiena di una riduzione della pressione grave.

Il futuro del trapianto di isolotto è in tre tecnologie convergenti: biologia delle cellule staminali, editing genico e incapsulamento. La capacità di generare quantità illimitate di cellule islettere funzionali da cellule staminali, combinate con l'ingegneria genetica per renderle invisibili al sistema immunitario, potrebbe produrre un prodotto fuori-the-shelf disponibile a qualsiasi paziente senza la necessità di immunosoppressione.

Per ulteriori informazioni, ] Istituto Nazionale di diabete e malattie del rene[]] fornisce informazioni complete del paziente. Registro internazionale dell'isolotto traccia risultati globali e dati clinici.