Table of Contents

Введение: Возникающее обещание экзосомных миРНК при диабете

Сахарный диабет, хроническое метаболическое расстройство, поражающее более 537 миллионов взрослых во всем мире, согласно Атласу диабета IDF (2021), продолжает налагать тяжелое бремя на глобальные системы здравоохранения. Современные диагностические инструменты первой линии - голодание глюкозы в плазме, тесты на толерантность к глюкозе и HbA1c - имеют хорошо известные ограничения: они часто обнаруживают заболевание только после того, как произошла значительная дисфункция бета-клеток, и они дают мало понимания основных патологических процессов или риска осложнений. Необходимость в биомаркерах, которые позволяют более раннее обнаружение, лучшую стратификацию риска и персонализированное управление, является неотложной. За последнее десятилетие новый класс молекулярных мессенджеров появился в качестве перспективного решения: экзосомные микроРНК (миРНК). Эти небольшие, некодирующие молекулы РНК, упакованные в внеклеточные везикулы, могут быть отобраны из крови, мочи и других биожидкостей, предлагая минимально инвазивное окно в клеточное состояние иначе недоступных тканей. Накопленные данные указывают на то, что экзосомные миРНК

Биология экзосом и микроРНК

Что такое экзосомы?

Экзосомы представляют собой внеклеточные везикулы нанометрового размера (30-150 нм в диаметре), которые высвобождаются практически всеми типами клеток во внеклеточное пространство. Они происходят из эндосомного пути: во время формирования многояйцевых тел внутриглазные везикулы запускаются внутрь; при слиянии многояйцевого тела с плазматической мембраной эти везикулы высвобождаются в виде экзосом. Их липидный бислой обогащается холестерином, сфингомиелином и тетраспанинами, такими как CD9, CD63 и CD81, которые придают замечательную стабильность биожидкостям. Внутри экзосомы несут селективный груз белков, липидов, мРНК и миРНК, которые могут быть переданы к клеткам-реципиентам, тем самым опосредуя межклеточную связь как в физиологическом, так и в патологическом контексте. Эта стабильность и их присутствие в легкодоступных биожидкостях делают экзосомы идеальными проводниками для открытия биомаркеров.

МикроРНК: регуляторы генов в миниатюре

МиРНК являются короткими (~22 нуклеотидов) некодирующими РНК, которые посттранскрипционно регулируют экспрессию генов путем связывания с комплементарными последовательностями в 3'-нетранслируемой области мРНК-мишеней, что обычно приводит к трансляционному подавлению или дестабилизации мРНК. Одна миРНК может модулировать экспрессию сотен транскриптов, помещая их в центр сложных регуляторных сетей. В контексте диабета миРНК влияют на секрецию инсулина, выживаемость бета-клеток, чувствительность к инсулину и воспалительные реакции. При избирательной загрузке в экзосомы эти миРНК могут транспортироваться в отдаленные клетки, изменяя функцию клеток-реципиентов паракринным или эндокринным образом. Профиль экзосомной миРНК часто отличается от функции родительской клетки, отражая активные, регулируемые механизмы сортировки, которые реагируют на клеточный стресс или состояние заболевания.

Биогенез и селективная загрузка экзосомных миРНК

Процесс, посредством которого миРНК сортируются в экзосомы, является весьма избирательным. Специфические мотивы последовательности, такие как «EXO-мотив» (GGAG), идентифицированные в определенных миРНК, распознаются РНК-связывающими белками, такими как hnRNPA2B1, которые направляют их в внутрилюминальные везикулы. Эндосомальный сортирующий комплекс, необходимый для транспортных (ESCRT) механизмов, наряду с обогащенными тетраспанином микродоменами, также играет роль в сортировке грузов. Дополнительные механизмы включают посттрансляционные модификации миРНК (например, 3'-конец уридилатации или аденилирования), которые влияют на их включение. Эта селективность подразумевает, что экзосомные миРНК являются не просто пассивным отражением клеточного транскриптома; вместо этого они представляют собой намеренно упакованное подмножество миРНК, которое передает конкретную информацию о физиологическом или патологическом статусе донорской клетки. Это свойство лежит в основе их ди

Экзосомальные миРНК в диабете Патогенез и прогрессирование

Бета-клеточная дисфункция и резистентность к инсулину

Сахарный диабет 2 типа (T2D) характеризуется прогрессирующей бета-клеточной недостаточностью и периферической резистентностью к инсулину. Экзосомные миРНК, полученные из островков поджелудочной железы, могут модулировать эти критические процессы. Например, miR-375, который высоко экспрессируется в бета-клетках, высвобождается в кровоток во время стресса бета-клеток и связан с нарушением секреции инсулина. Исследование 2018 года в Diabetologia продемонстрировало, что экзосомные уровни miR-375 в сыворотке крови повышены у преддиабетических индивидуумов и коррелируют с ухудшением функции бета-клеток. miR-27a, miR-130b, и miR-320 способствуют

Воспалительный перекрестный разговор

Хроническое низкосортное воспаление является отличительной чертой диабета. Экзосомальные миРНК, высвобождаемые из иммунных клеток — в частности макрофагов и Т-лимфоцитов — могут усиливать или ослаблять воспалительные каскады. miR-146a и miR-155 являются двумя хорошо изученными примерами с противоположными ролями: miR-146a в целом подавляет воспаление, нацеливаясь на TRAF6 и IRAK1, тогда как miR-155 способствует провоспалительному состоянию, нацеливаясь на SOCS-1 и SHIP-1. У пациентов с диабетом баланс между этими двумя миРНК в циркулирующих экзосомах часто смещается в сторону провоспалительного профиля, с повышенным miR-155 и уменьшенным miR-146a, коррелирующими с тяжестью заболевания и прогрессированием. Кроме того, экзосомные miR-142-3p

Ожирение и метаболический синдром

Ожирение является основным фактором T2D, и экзосомные миРНК являются центральными для перекрестного контакта между жировой тканью и другими органами. Экзосомы, полученные из адипоцитов, у людей с ожирением несут повышенные уровни miR-23b , miR-27a и miR-222 , которые могут способствовать воспалению и резистентности к инсулину в клетках реципиента. Исследование 2019 года показало, что экзосомальная миРНК печени, специфичная для печени, заметно повышена у людей с метаболическим синдромом и коррелирует с содержанием жира в печени и резистентностью к инсулину. Такие результаты показывают, что экзосомные миРНК могут служить ранними показателями метаболической дисфункции даже до того, как гомеостаз глюкозы скомпрометирован.

Диагностический потенциал экзосомных миРНК при диабете

Неинвазивная жидкая биопсия

Одним из самых больших преимуществ экзосомных микроРНК в качестве биомаркеров является их доступность. Экзосомы могут быть выделены из простого анализа крови, образца мочи, слюны или даже слез. Их липидный бислой защищает заключенные миРНК от эндогенных RNases, что делает их удивительно стабильными в хранящихся образцах - исследования сообщили, что экзосомные миРНК остаются поддающимися количественной оценке даже после нескольких циклов замерзания-оттепели или длительного хранения при -80 ° C. Доступны различные методы изоляции, включая ультрацентрифугирование, хроматографию на основе исключения размера, осаждение на основе полимера и захват иммуноаффинности. В то время как наборы осаждения удобны для клинических лабораторий, ультрацентрифугирование остается золотым стандартом для чистоты. Международное общество внеклеточных везикул (ISEV) опубликовало руководящие принципы (MISEV2018) для стандартизации этих процедур, хотя изменчивость в лабораториях остается проблемой.

Специфические экзосомные подписи миРНК при диабете 2 типа

Исследования выявили несколько экзосомных миРНК, которые последовательно дисрегуляируются у пациентов с T2D по сравнению со здоровыми контрольными. Мета-анализ 13 исследований, опубликованных в 2019 году, сообщил, что экзосомные miR-21, miR-126 и miR-29a являются одними из наиболее воспроизводимых кандидатов. В следующем списке приведены ключевые примеры и их функциональная значимость:

  • miR-21: Повышенная регуляция в сывороточных и плазменных экзосомах у пациентов с T2D; нацелена на PTEN и PDCD4, способствуя резистентности к инсулину и воспалению. Уровни коррелируют с ожирением и HbA1c.
  • miR-126: Пониженная регуляции в циркулирующих экзосомах; уровни коррелируют с эндотелиальной дисфункцией и наличием сосудистых осложнений.Исследование 2018 года показало, что снижение экзосомного miR-126 может предсказать прогрессирование от нормогликемии до преддиабета с чувствительностью 82% и специфичностью 76%.
  • miR-29 семейства (miR-29a, b, c): Повышенный уровень экзосом у диабетиков; связанный с апоптозом бета-клеток и нарушением секреции инсулина. уровни miR-29a в мочевых экзосомах также связаны с ранним фиброзом почек.
  • miR-223: Повышенный уровень в тромбоцитах, полученных экзосомами в T2D; связи с воспалением и коагуляцией. Может служить ранним маркером эндотелиальной активации.
  • miR-320b: Более высокие уровни в экзосомах плазмы предсказывают начало T2D у людей с преддиабетом, независимо от традиционных факторов риска.
  • miR-144-5p: Снижение экзосом у лиц, устойчивых к инсулину; участие в передаче сигналов инсулина путем нацеливания на IRS-1.

Важно отметить, что изменения в этих экзосомных миРНК часто предшествуют изменениям в обычных биомаркерах, таких как глюкоза натощак или HbA1c, что указывает на роль в раннем обнаружении.

Различают диабет 1 типа и латентный аутоиммунный диабет

Экзосомальные миРНК также демонстрируют перспективность дифференцирования подтипов диабета. При диабете 1 типа (T1D) аутоиммунное разрушение бета-клеток отражается специфическими экзосомными изменениями миРНК. miR-375 и miR-200c повышены в сыворотке недавно появившихся пациентов с T1D, отражающими стресс бета-клеток и апоптоз. Другое исследование выявило группу из пяти экзосомных миРНК (miR-21, miR-29b, miR-126, miR-146a и miR-375), которые могли бы отличать T1D от T2D с точностью >90%, что потенциально помогло в лечении пациентов с неоднозначными клиническими особенностями, такими как латентный аутоиммунный диабет у взрослых (LADA). Исследование 2021 года расширило эту работу, показав, что экзосомальные miR-21-5p и miR-10

Гестационный диабет Mellitus

Новые данные свидетельствуют о том, что экзосомные миРНК изменяются и при гестационном сахарном диабете (ГДМ). В исследовании 2022 года сообщалось, что экзосомные плазмы miR-222-3p и miR-146a-5p значительно повышены у женщин с ГДМ по сравнению с нормогликемическими беременными контрольными, и эти изменения можно обнаружить уже в первом триместре. Если их проверить, экзосомные тесты миРНК могут обеспечить более ранний скрининг и управление ГДМ, уменьшая осложнения у матери и плода.

Прогностическая ценность: прогнозирование осложнений и траектории заболевания

Диабетическая нефропатия

Диабетическая болезнь почек (DKD) является основным микрососудистым осложнением, которое поражает около 30-40% пациентов с диабетом. Экзосомальные миРНК из почечных клеток могут сигнализировать о раннем повреждении до снижения протеинурии или eGFR. Было показано, что экзосомные мочи miR-192 , miR-29c и miR-21 коррелируют с маркерами фиброза, такими как TGF-β1 и осаждение коллагена в почках. Продольное исследование пациентов с T2D в течение пяти лет показало, что высокие исходные уровни экзосомальной миР-21 и низкой miR-29c предсказывали более быстрое прогрессирование до конечной стадии почечной болезни, независимо от HbA1c и альбуминурии. Другое исследование определило экзосомальную мочу miR-

Диабетическая ретинопатия

В диабетической ретинопатии (DR) экзосомные миРНК из эндотелиальных клеток сетчатки и перицитов способствуют ангиогенезу и воспалению. miR-126, miR-150 и miR-200b относятся к числу миРНК, экзосомальные уровни которых изменяются с тяжестью DR. Исследование 2021 года показало, что экзосомальный miR-150 в плазме значительно снижается у пациентов с пролиферативной DR, а его уровень коррелирует с риском стекловидного кровоизлияния. Кроме того, экзосомальные miR-30b-5p и miR-320a были предложены в качестве биомаркеров для перехода от непролиферативных к пролифератив

Сердечно-сосудистые осложнения

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти при диабете. Экзосомальные миРНК из клеток сердца, сосудов и тромбоцитов обеспечивают понимание стресса миокарда, атеросклероза и тромбоза. miR-1, miR-133 и miR−208 являются миРНК, специфичными для мышц, которые появляются в кровообращении после сердечной травмы; при диабете даже субклиническое повреждение миокарда может изменять экзосомные профили миРНК. Недавняя многоцентровая когорта (2022) продемонстрировала, что композитный балл на основе экзосомных miR-126, miR-223 и miR-146a у пациентов с Т2D улучшил прогноз основных неблагоприятных сердечно-сосудистых событий (MACE) у пациентов с Т2D за пределами традиционных факторов риска (AUC увеличился с 0,71

Интеграция с клиническими показателями риска

Прогностическая ценность экзосомных миРНК значительно повышается в сочетании с существующими клиническими параметрами. Например, добавление экзосомных миР-21 и миР-192 в классификацию KIDGO улучшило дискриминацию быстрой и медленной прогрессии DKD в когорте валидации (C-статистика от 0,72 до 0,81). Аналогичным образом, включение экзосомных миР-126 и миР-146a в плазму в оценку риска Фрамингема улучшило реклассификацию пациентов с T2D при промежуточном сердечно-сосудистом риске. Эта синергия предполагает, что экзосомные миРНК панели могут служить в качестве сопутствующей диагностики для уточнения стратификации риска и руководства терапевтическими решениями.

Клинические применения и проблемы

Текущее состояние перевода

Хотя потенциал экзосомных миРНК огромен, клиническое принятие таких тестов сталкивается с несколькими существенными препятствиями. Стандартизация доаналитических переменных - включая трубки для сбора крови, условия хранения, методы изоляции экзосом и стратегии нормализации миРНК - по-прежнему отсутствует. Руководящие принципы MISEV 2018, опубликованные ISEV, способствовали строгости, но межлабораторная изменчивость остается значительной. Большие, перспективные, многоцентровые испытания с этнически разнообразными популяциями срочно необходимы для проверки первоначальных результатов и установления эталонных диапазонов.

Технические соображения

  • Эффективность изоляции: Ни один метод не восстанавливает все экзосомы одинаково; ультрацентрифугирование дает высокую чистоту, но является трудоемким и не легко масштабируемым. Хроматография с исключением размера и наборы осадков быстрее, но могут совместно изолировать неэкзосомальные частицы и белковые агрегаты. Сравнительные исследования сообщают только умеренную конкордансность между методами, усложняя перекрестные сравнения исследований.
  • РНК-экстракция и количественное определение: Экзосомальные выходы миРНК часто являются низкими, особенно из мочи или слюны, что требует чувствительных методов обнаружения. Количественный ПЦР (qPCR) является наиболее распространенным подходом, но секвенирование следующего поколения (NGS) все чаще используется для обнаружения. Цифровая капельная ПЦР обеспечивает более высокую точность для абсолютного количественного определения.
  • Нормализация: Обычно используемые контрольные показатели шипа (например, cel-miR-39) или эндогенные ссылки (например, miR-16, miR-10b или miR-451a) имеют оговорки: сам miR-16 изменяется при диабете и некоторых видах рака. Рекомендуется использование множественных эталонных миРНК или глобальная средняя нормализация, но еще не стандартизирована.
  • Когортная гетерогенность: Многие исследования являются небольшими (<100 участников) и не имеют подтверждения в независимых когортах. Возраст, пол, индекс массы тела, использование лекарств (например, метформин, статины) и сопутствующие заболевания могут влиять на экзосомные профили миРНК, но лишь немногие исследования объясняют эти вмешивающиеся факторы.

Регулирующие и барьеры затрат

Прежде чем экзосомные тесты миРНК могут войти в клинические рекомендации, они должны продемонстрировать не только аналитическую обоснованность, но и клиническую полезность, то есть доказательства того, что их использование улучшает результаты пациентов по сравнению с текущей практикой. Несколько компаний, включая Exosome Diagnostics (бренд Bio-Techne) и стартапы на основе miR, разработали анализы для онкологии, но ни одна из них еще не получила одобрение FDA для показаний к диабету. Стоимость qPCR или NGS снижается, но она остается выше, чем обычные анализы крови. Пути возмещения неясны, и необходимы экономические анализы здоровья, чтобы оправдать дополнительные расходы.

Будущие направления и новые исследования

Искусственный интеллект для обнаружения подписи MiRNA

Алгоритмы машинного обучения все чаще применяются к большим наборам данных экзосомной миРНК для выявления закономерностей, которые избегают традиционных статистических подходов. Случайные леса, машины с опорными векторами и модели глубокого обучения были обучены на профилях миРНК для классификации статуса диабета и прогнозирования осложнений. В одном исследовании, основанном на доказательстве концепции, случайная лесная модель с использованием 384 экзосомных миРНК достигла AUC 0,94 для отличия T2D от здоровых элементов управления в независимом наборе тестов. Такой анализ на основе ИИ может помочь выявить надежные панели, которые обобщают популяцию и платформы.

Экзосомальные микроРНК как терапевтические мишени

Помимо диагностики, экзосомные миРНК исследуются в качестве терапевтических агентов или мишеней. Инженерные экзосомы для доставки анти-miR олигонуклеотидов или миРНК-мимиков являются активной областью доклинических исследований. Например, экзосомы, нагруженные мимикой miR-146a, как было показано, уменьшают воспаление и улучшают чувствительность к инсулину на моделях диабетических мышей. И наоборот, доставляемые экзосомами антагомиры, нацеленные на miR-21, могут облегчить почечный фиброз на моделях DKD. Клинические испытания для терапии на основе миРНК уже ведутся для других заболеваний (например, гепатита С, рака), и диабет является логической следующей целью, хотя доставка, стабильность и побочные эффекты остаются проблемами.

Комбинация с другими омами

Интеграция профилирования экзосомной миРНК с протеомикой, метаболомикой и эпигеномикой может обеспечить более полную картину патофизиологии диабета. Мультиомические подходы могут идентифицировать причинные пути, выявлять подтипы заболеваний и обеспечивать точную медицину - сопоставление пациентов с лечением на основе их молекулярного профиля. Ранние усилия по комбинированию экзосомной миРНК с метаболомными данными улучшили прогнозирование прогрессирования DKD, но необходима дальнейшая работа для перевода этих подходов в клинические инструменты.

Заключение

Экзосомальные миРНК представляют собой сдвиг парадигмы в том, как мы подходим к диагностике, мониторингу и прогнозу диабета. Их присутствие в легкодоступных биожидкостях, исключительная стабильность и способность отражать клеточную патологию делают их идеальными биомаркерами для раннего выявления и стратификации риска. В то время как значительные проблемы - стандартизация, валидация, одобрение регулирующих органов и стоимость - должны быть преодолены, накопление доказательств из сотен исследований за последнее десятилетие убедительно указывает на будущее, где жидкие биопсии профилей экзосомных миРНК становятся рутинной частью лечения диабета. Путь от исследований до клинической реализации длинен, но потенциал для улучшения результатов для сотен миллионов людей, страдающих диабетом, делает этот путь необходимым.

Дополнительное чтение: Для всестороннего обзора биологии экзосом см. 2019 обзор в Эндокринные обзоры . Для обновлений о терапии миРНК при метаболических заболеваниях, проконсультируйтесь эта статья 2022 года в Nature Reviews Эндокринология . Международное общество внеклеточных везикул предоставляет текущие руководящие принципы для исследований экзосом. Кроме того, перспектива 2023 года на клинический перевод экзосомных биомаркеров можно найти в Диабет (2023).