Table of Contents

Введение: растущее бремя диабетических сосудистых осложнений

Сахарный диабет в настоящее время поражает более 530 миллионов взрослых во всем мире, цифра, по прогнозам, превысит 780 миллионов к 2045 году. Хроническая гипергликемия - определяющая особенность диабета - инициирует сложный каскад метаболических, воспалительных и гемодинамических нарушений, которые постепенно повреждают эндотелий, одноклеточную слизистую оболочку кровеносных сосудов. Эта эндотелиальная травма является общим корнем как макрососудистых осложнений (болезнь коронарной артерии, инсульт, заболевание периферических артерий), так и микрососудистых осложнений (ретинопатия, нефропатия, нейропатия). Раннее выявление сосудистых повреждений имеет решающее значение, потому что эти осложнения часто остаются бессимптомными до продвинутых, необратимых стадий. Традиционные диагностические инструменты, такие как ангиография, сонная интима-медиа толщина или альбуминурия обнаруживают установленное заболевание, пропуская окно, когда вмешательство может все еще предотвратить или остановить прогрессирование. Неинвазивные биомаркеры, которые отражают продолжающуюся эндотелиальную

Эндотелий при диабетической сосудистой болезни

Нормальная эндотелиальная функция и гомеостаз

Здоровый эндотелий — это гораздо больше, чем пассивный барьер. Он активно регулирует сосудистый тонус, тромбоз, воспаление и проницаемость. Эндотелиальные клетки выделяют оксид азота (NO) и простациклин для поддержания сосудорасширения, предотвращения агрегации тромбоцитов, ингибируют адгезию лейкоцитов и подавляют пролиферацию гладких мышц. Целостность этого монослоя сохраняется благодаря тонкому равновесию между обновлением клеток (из соседних эндотелиальных клеток и клеток-предшественников костного мозга) и клеточным оборотом (апоптоз или отслоение). Когда этот баланс нарушается, эндотелий становится дисфункциональным, создавая почву для атеросклероза и микрососудистой окклюзии.

Гипергликемия-индуцированная эндотелиальная травма: ключевые механизмы

Хроническое воздействие повышенного уровня глюкозы повреждает эндотелиальные клетки через несколько взаимосвязанных путей:

  • Повышенный окислительный стресс: Гипергликемия приводит к перепроизводству митохондриальных активных форм кислорода (ROS). ROS инактивирует NO, способствует перекисному окислению липидов и активирует провоспалительные факторы транскрипции, такие как NF-κB.
  • Формирование конечных продуктов гликирования (AGE): Неферментативная гликация белков, липидов и нуклеиновых кислот приводит к AGE, которые связываются с рецепторами (RAGE) на эндотелиальных клетках, вызывая окислительный стресс, воспаление и апоптоз.
  • Активация полиольного пути: Избыток глюкозы превращается в сорбит, истощая NADPH и глутатион, тем самым снижая антиоксидантную способность.
  • Активация протеинкиназы C (PKC): Гипергликемия увеличивает диацилглицерин, который активирует изоформы PKC. PKC ухудшает производство NO, повышает эндотелиальную проницаемость и способствует экспрессии прокоагулянтных и провоспалительных молекул.

Эти оскорбления коллективно нарушают передачу NO сигнала, способствуют протромботическому и провоспалительному состоянию и ускоряют апоптоз и отслоение эндотелиальных клеток. Результатом является дисфункциональный, протекающий эндотелий, склонный к атеросклерозу, тромбозу и микрососудистой окклюзии.

Измерение эндотелиального повреждения: концепция циркулирующих эндотелиальных клеток

Когда эндотелиальные клетки повреждены, они отделяются от подвальной мембраны и попадают в кровоток. Эти отсоединенные клетки называются циркулирующими эндотелиальными клетками (ЦЭК). У здоровых людей количество ЦИК чрезвычайно низкое - обычно менее 20 клеток на миллилитр крови, при этом большинство исследований сообщают о <10 клетках / мл. Повышенные показатели ЦИК наблюдаются в условиях, отмеченных значительными эндотелиальными травмами, включая диабет, гипертонию, острые коронарные синдромы, васкулит и сепсис. При диабете уровни ЦИК коррелируют с продолжительностью заболевания, гликемическим контролем (HbA1c) и наличием и тяжестью осложнений. Поскольку ЦИК происходят непосредственно из стенки сосуда, они обеспечивают прямой снимок в реальном времени продолжающейся эндотелиальной травмы, что делает их уникальным и ценным биомаркером.

Циркулирующие эндотелиальные клетки как биомаркеры диабетического сосудистого повреждения

Происхождение, идентификация и фенотипирование

ЦИК являются зрелыми, неизлечимо дифференцированными эндотелиальными клетками, которые отлили от интимальной подкладки. Их можно идентифицировать по экспрессии эндотелиальных специфических маркеров, таких как CD146 (Mel-CAM), CD31 (PECAM-1), фактор фон Виллебранда (vWF) и CD105 (эндоглина), в сочетании с отсутствием гемопоэтического маркера CD45. Используя проточную цитометрию или иммуномагнитное разделение, исследователи подсчитывают ЦИК и характеризуют их жизнеспособность - различая жизнеспособные, апоптотичные и некротические подтипы. Этот фенотип может предоставить дополнительную информацию: например, преобладание апоптотических ЦИК предполагает продолжающееся повреждение с сохраненным апоптотическим механизмом, в то время как некротические ЦИК указывают на более серьезные, литические повреждения. Размер, гранулярность и плотность поверхностных маркеров ЦИК также могут варьироваться в зависимости от сосудистого слоя происхождения и типа оскорбления.

Клинические данные: повышенные КЭС при диабете

Растущий объем данных свидетельствует о том, что у пациентов с диабетом 1 и 2 типа значительно выше показатели ЦИК по сравнению с возрастными контрольными показателями. Важнейшее исследование, проведенное McClung et al. (2008), показало, что уровни ЦИК были в три-четыре раза выше у пациентов с диабетом и коррелировали положительно с HbA1c и с микроальбуминурией, ранним маркером нефропатии. Последующие исследования подтвердили, что показатели ЦИК увеличиваются с продолжительностью диабета и ухудшаются с развитием осложнений. В диабетической ретинопатии показатели ЦИК прогрессивно возрастают от непролиферативной до пролиферативной стадий, отражая распад гемато-ретинального барьера. В нефропатии уровни ЦИК коррелируют с уровнем экскреции альбумина и снижением уровня ЭГФР. В нейропатии более высокие показатели ЦИК связаны с уменьшением скорости нервной проводимости и симптоматической периферической нейропатией. Примечательно, что уровни ЦИК также предсказывают будущие сердечно-сосудистые события в диабетических популяциях, независимо от традиционных факторов

ЦИК и макрососудистые осложнения

У больных сахарным диабетом и установленной болезнью коронарных артерий показатели ЦИК дополнительно повышены по сравнению с диабетическими пациентами без коронарной болезни. Числа ЦИК коррелируют с степенью коронарного атеросклероза, оцениваемой коронарной ангиографией или КТ кальциевым скорингом. Что еще более важно, фенотип ЦИК может отражать нестабильность бляшек: у пациентов с острым коронарным синдромом более высокая доля апоптотиков или некротических ЦИК по сравнению со стабильными стенокардией. Это говорит о том, что ЦИК не только указывают на тяжесть поражения эндотелия, но и могут обнаруживать активную эрозию или разрыв бляшек, обеспечивая окно в патофизиологию острых сосудистых событий. Аналогично при заболевании периферических артерий уровни ЦИК повышены у пациентов с критической ишемией конечностей и падают после успешной реваскуляризации.

ЦИК и микрососудистые осложнения

Микрососудистые заболевания являются отличительной чертой диабета, и ЦИК были изучены во всех основных органах-мишенях:

  • Ретинопатия: Числа ЦИК увеличиваются при стадии ретинопатии, от легкой непролиферативной до пролиферативной диабетической ретинопатии. Они связаны с стекловидными уровнями сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и с разрушением гемато-ретинального барьера.
  • Нефропатия: Повышенные показатели ЦИК коррелируют с соотношением альбумин-креатинин в моче и с гистологическими доказательствами клубочковой эндотелиальной травмы. Они также предсказывают прогрессирование альбуминурии и снижение функции почек.
  • Невропатия: Эндотелиальная дисфункция нервной вазы способствует ишемии нерва. Исследования показывают более высокие показатели ЦИК у пациентов с симптоматической диабетической нейропатией по сравнению с теми, у кого нет, и уровни ЦИК коррелируют с показателями тяжести нейропатии.

Эти ассоциации поддерживают ЦИК как объединяющий маркер повреждения микрососудистой системы в различных системах органов, что потенциально позволяет провести один анализ крови для оценки общей микрососудистой нагрузки.

Другие эндотелиальные биомаркеры: микрочастицы и клетки-предшественники

Эндотелиальные микрочастицы (EMPs)

Эндотелиальные микрочастицы представляют собой небольшие (0,1-1 мкм) мембранные пузырьки, высвобождающиеся из эндотелиальных клеток, подвергающихся активации, повреждению или апоптозу. Они несут поверхностные белки (например, CD144, CD146, CD31), цитоплазматические компоненты и микроРНК, которые отражают состояние родительской клетки. При диабете уровни ЭМП повышены и коррелируют с HbA1c, маркерами окислительного стресса и наличием сосудистых осложнений. ЭМП являются прокоагулянтными (обнажающими фосфатидилсерин и тканевый фактор) и провоспалительными, активно способствующими продолжающейся сосудистой патологии. По сравнению с ЦЕП, ЭМП более распространены в кровообращении и могут захватывать информацию об активации эндотелия в дополнение к травме. Однако их небольшой размер делает обнаружение и стандартизацию более сложными, а различные методы изоляции дают различные результаты.

Циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники (EPCs)

Эндотелиальные клетки-предшественники — это клетки, полученные из костного мозга, которые мигрируют в места повреждения сосудов и способствуют восстановлению эндотелия. Они экспрессируют характерные маркеры, такие как CD34, KDR (VEGFR-2) и CD133. При диабете снижается как количество, так и функциональная способность EPC, что отражает нарушение восстановления сосудов. Считается, что баланс между травмой (CEC, EMP) и восстановлением (EPC) определяется чистым сосудистым здоровьем. Соотношение CEC/EPC, в частности, было предложено в качестве более всеобъемлющего биомаркера: высокое соотношение указывает на продолжающуюся травму с недостаточным восстановлением, сценарий, тесно связанный с прогрессированием диабетических осложнений. Комбинирование CEC, EMP и EPC в мультимодальной оценке может обеспечить более полную картину здоровья эндотелия, чем любой один маркер.

Клиническая значимость и практические применения

Стратификация рисков

Измерение ЦИК и связанных с ними биомаркеров может идентифицировать пациентов с диабетом с самым высоким риском сосудистых событий, даже когда традиционные факторы риска кажутся хорошо контролируемыми. Например, пациент с HbA1c 7,5%, но заметно повышенным ЦИК может заслужить более агрессивное управление глюкозой, более раннее начало антиагрегантной терапии или более ранний скрининг на ретинопатию и нефропатию. Уровни ЦИК также могут помочь решить, когда начинать терапию статинами или ингибиторами АПФ за пределами текущих порогов на основе оценки риска. В группах среднего риска добавление измерения ЦИК к калькулятору риска ASCVD может улучшить дискриминацию и реклассификацию.

Мониторинг ответов на лечение

Повреждение эндотелия потенциально обратимо с улучшенным гликемическим контролем, изменениями образа жизни и фармакологическими вмешательствами. Несколько исследований показали, что уровни ЦЕК и ЭМП снижаются после лечения инсулином, метформином или более новыми агентами, такими как ингибиторы SGLT2 и агонисты рецепторов GLP-1. Например, исследование 2022 года показало, что шесть месяцев терапии дапаглифлозином снизили количество ЦЕК на 40% у пациентов с диабетом 2 типа и сердечной недостаточностью. Аналогичным образом, такие вмешательства, как контролируемая тренировка упражнений, диетическая модификация и прекращение курения, уменьшают маркеры эндотелиального повреждения. Серийный мониторинг ЦЕК может обеспечить объективную меру эффективности лечения в реальном времени и помочь мотивировать приверженность пациента. В клинических испытаниях эндотелиальные биомаркеры могут служить суррогатными конечными точками для сосудистых исходов, потенциально сокращая продолжительность исследования и уменьшая требования к размеру выборки.

Предсказание сердечно-сосудистых событий

Перспективные данные подтверждают способность ЦИК прогнозировать будущие сердечно-сосудистые события как в диабетической, так и в недиабетической популяциях. Мета-анализ 10 исследований с участием более 2500 пациентов показал, что повышенные ЦИК были связаны с 2,5-кратным увеличением риска основных неблагоприятных сердечно-сосудистых событий (MACE). Важно отметить, что эта связь оставалась значительной после корректировки на традиционные факторы риска, включая возраст, пол, курение, гипертонию и холестерин липопротеинов низкой плотности. Добавление измерения ЦИК к существующим моделям прогнозирования риска (например, механизм риска UKPDS для диабета) может улучшить дискриминацию и реклассификацию, особенно у пациентов, классифицированных как промежуточный риск. Это может привести к более раннему и более целенаправленному использованию профилактических методов лечения.

Методы измерения и проблемы

Цитометрия потока

Наиболее распространенным методом количественной оценки ЦИК является проточная цитометрия с использованием флуоресцентно меченных антител против эндотелиальных маркеров, таких как CD146, CD31 и CD105, исключая CD45-позитивные лейкоциты. Однако, для отличия истинных ЦИК от тромбоцитов (которые экспрессируют CD31), агрегатов тромбоцитов и клеточного мусора требуется тщательное проглатывание и использование красителей жизнеспособности (например, 7-AAD, пропидиевый йодид). Межлабораторная изменчивость остается основным препятствием для клинического принятия. Такие факторы, как время от притяжения крови до обработки, тип антикоагулянта (EDTA vs. цитрат), температура хранения и скорость центрифугирования, все влияют на подсчеты ЦИК. Руководящие принципы консенсуса от Международного общества по тромбозу и гемостазу (ISTH) стандартизировали некоторые аспекты, но различия в панелях антител, стратегиях прокалывания и протоколах перечисления сохраняются. Усилия по гармонизации,

Иммуномагнетическое разделение

Этот метод использует магнитные шарики, покрытые анти-CD146 или анти-CD34 антителами для захвата ЦИК из цельной крови. Затем захваченные клетки окрашиваются эндотелиальными флуоресцентными антителами и подсчитываются вручную или с помощью автоматизированной микроскопии. Иммуномагнитное разделение дает высокую чистоту и позволяет проводить подробную морфологическую оценку, но оно требует трудоемкого, требует специального оборудования и менее подходит для высокопроизводительных клинических лабораторий. Новые автоматизированные платформы, такие как система RareCyte или система CellSearch (уже очищенная FDA для циркулирующих опухолевых клеток), направлены на оптимизацию изоляции и анализа, но их производительность для ЦИК при диабете не была тщательно проверена.

Молекулярный и омический подходы

Новые методы сосредоточены на измерении транскриптов РНК, микроРНК или моделей метилирования ДНК, высвобождаемых в циркуляцию. Например, эндотелиальные микроРНК, такие как miR-126, miR-92a и miR-222, обогащены в ЦИК и ЭМП и могут предоставлять информацию о функциональном состоянии отсоединенных клеток. Протеомное профилирование ЦИК и ЭМП может идентифицировать новые маркеры повреждения и восстановления сосудов. Хотя эти подходы все еще находятся на стадии исследования, они имеют потенциал для повышения чувствительности и специфичности и обеспечения механистических знаний за пределами подсчета клеток.

Стандартизация и справочные диапазоны

Критическим барьером для клинического использования является отсутствие широко признанных эталонных диапазонов. Показатель CEC варьируется в зависимости от возраста (выше у пожилых людей), пола, недавних физических упражнений (преходящее увеличение) и даже циркадного ритма. У здоровых людей большинство лабораторий сообщают о нормальном диапазоне 0-10 клеток / мл, но некоторые ссылаются на до 20 клеток / мл. Без консенсусных отсечек интерпретация отдельных результатов затруднена. Многоцентровые совместные усилия, такие как координируемые Институтом сосудистой медицины и Европейской сетью сосудистой биологии, работают над установлением нормативных данных в различных популяциях, определяют клинически значимые пороги и проверяют пределы принятия решений, которые предсказывают результаты.

Будущие направления

Интеграция с другими биомаркерами и машинным обучением

Полный потенциал биомаркеров ЦИК может быть реализован в сочетании с другими эндотелиальными мерами (EMP, EPC, sICAM-1, sVCAM-1, sE-селектин) и клиническими переменными. Многовариабельные модели, которые включают подсчеты ЦИК, HbA1c, артериальное давление, липидный профиль и биомаркеры воспаления (hs-CRP), могут превзойти текущие калькуляторы риска. Алгоритмы машинного обучения могут помочь идентифицировать сложные, нелинейные модели изменений биомаркеров, которые предшествуют клиническим событиям, потенциально позволяя прогнозировать недели или месяцы до появления симптомов. Такие модели могут быть интегрированы в электронные медицинские записи для обеспечения поддержки принятия решений в режиме реального времени.

Устройства Point-of-Care

Миниатюрные проточные цитометры, микрофлюидные чипы и устройства для подсчета клеток на основе изображений, которые могут подсчитывать и характеризовать ЦИК у постели, находятся в активном развитии. Например, портативное устройство, использующее акустическую фокусировку клеток и лазерное обнаружение флуоресценции, может сообщать о подсчетах ЦИК в течение нескольких минут от одной капли крови. Если эта технология будет подтверждена, она может быть развернута в отделениях первичной медико-санитарной помощи, эндокринологических клиниках или даже в домашних условиях для мониторинга, чтобы направлять управление диабетом и расширять возможности пациентов.

ДНК без клеток эндотелиального происхождения

Другой развивающейся областью является измерение ДНК без клеток (cfDNA), полученной из эндотелиальных клеток. Во время апоптоза или некроза эндотелиальные клетки высвобождают фрагменты ДНК в кровоток. Цепная реакция метилирования-специфической полимеразы может количественно определять фрагменты с эндотелиально-специфическими паттернами метилирования (например, в генном промоторе CDH5). Этот подход не требует интактных клеток, избегает многих преданалитических проблем и может быть выполнен на хранящихся образцах плазмы, облегчая крупномасштабные ретроспективные исследования. Ранние данные свидетельствуют о том, что уровни эндотелиальной cfDNA коррелируют с подсчетами CEC и предсказывают сосудистые исходы при диабете.

Персонализированная сосудистая помощь

В конечном счете, эндотелиальные биомаркеры могут стать краеугольным камнем персонализированной медицины для диабета. «сосудистый фенотип» пациента, отражающийся в относительном обилии ЦИК, ЭМП и ЭПК, может направлять выбор наиболее подходящего снижающего уровень глюкозы агента, антигипертензивного или антитромбоцитарного режима. Например, человек с высоким уровнем ЦИК и низким количеством ЭПК может преимущественно получать пользу от ингибитора SGLT2, который, как было показано, увеличивает количество ЭПК и уменьшает ЦИК в некоторых исследованиях. Обратная связь с биомаркерами в реальном времени также может помочь пациентам понять связь между ежедневным поведением (диета, физические упражнения, сон) и их сосудистым здоровьем, усиливая модификации образа жизни.

Заключение

Циркулирующие биомаркеры эндотелиальных клеток предлагают прямое, неинвазивное окно в сосудистое повреждение, которое лежит в основе наиболее опасных осложнений диабета. Повышенные показатели ЦИК сигнализируют о продолжающейся эндотелиальной травме, в то время как комбинированная оценка с эндотелиальными микрочастицами и клетками-предшественниками обеспечивает более полную картину баланса восстановления травмы. Несмотря на постоянные проблемы в стандартизации, измерении и установлении контрольного диапазона, клиническое обещание этих маркеров является существенным. Они могут улучшить стратификацию риска за пределами традиционных факторов, контролировать терапевтический ответ в реальном времени и прогнозировать будущие сердечно-сосудистые события. По мере того, как методы измерения зрелые и крупномасштабные исследования валидации могут стать реальностью. Клиницисты, которые понимают эти биомаркеры, будут лучше оснащены для выявления пациентов с риском ранее и адаптировать вмешательства для сохранения здоровья сосудов, в конечном итоге уменьшая тяжелое бремя диабетических сосудистых заболеваний.

Избранные ссылки

  • McClung JA, Naseer N, Saleem M, et al. Циркулирующие эндотелиальные клетки повышены у пациентов с сахарным диабетом 2 типа независимо от HbA1c. Диабетология 2008;51(8):1441–1448. DOI
  • Дигнат-Джордж Ф., Буланже КМ. Многогранности эндотелиальных микрочастиц. Артериосклеер Thromb Vasc Biol 2011;31(1):27-33. DOI
  • Фадини ГП, Авогаро А. Регенеративный потенциал эндотелиальных клеток-предшественников при диабете. Диабетология 2022;65(12):1999–2011. DOI
  • Видлански М.Е., Гокче Н., Кинни JF Jr., Вита JA. Клинические последствия эндотелиальной дисфункции. J Am Coll Cardiol 2003;42(7):1149–1160. DOI
  • Американская диабетическая ассоциация. Стандарты ухода при диабете — 2024. Лечение диабета 2024;47 (Поставка 1.] DOI