Table of Contents

Понимание аутоиммунитета и поджелудочной железы

Аутоиммунные заболевания возникают, когда иммунная система ошибочно идентифицирует самоантигены как угрозы, устанавливая устойчивую атаку на здоровые ткани. При диабете 1 типа (T1D) мишенью являются инсулин-продуцирующие бета-клетки, расположенные в островках поджелудочной железы Лангерганса. Генетическая восприимчивость в сочетании с экологическими триггерами — такими как вирусные инфекции или диетические факторы — может инициировать активацию аутореактивных Т-клеток. Эти иммунные клетки проникают в островки, высвобождают провоспалительные цитокины (например, интерферон-гамма, фактор некроза опухоли-альфа) и непосредственно разрушают бета-клетки через перфорин и опосредованную гранзимом цитотоксичность. Прогрессирующая потеря массы бета-клеток приводит к абсолютной недостаточности инсулина, гипергликемии и пожизненной зависимости от экзогенного инсулина. В то время как инсулинотерапия спасает жизнь, она не останавливает основной аутоиммунный процесс, а также не предотвращает долгосрочные осложнения,

Сама поджелудочная железа обладает ограниченной регенеративной способностью, а пересаженные островки из донорских источников уязвимы к той же аутоиммунной атаке, если пациенты не получают пожизненную иммуносупрессию. Эта клиническая реальность заставила исследователей изучить альтернативные подходы, которые могут защищать или заменять бета-клетки без системного подавления иммунитета. Редактирование генов предлагает точный инструмент для непосредственного изменения генетического состава бета-клеток или их предшественников, делая их невидимыми или устойчивыми к аутоиммунной атаке. Стратегии варьируются от удаления генов, которые кодируют ключевые молекулы иммунного распознавания, до введения защитных трансгенов, нейтрализующих местное воспаление.

Механизмы аутоиммунной атаки на бета-клетки

Генетические драйверы аутоиммунитета

Более 50 генетических локусов были связаны с риском T1D, причем область HLA на хромосоме 6 вносила самый сильный эффект. Специфические гаплотипы HLA класса II (например, DR3-DQ2, DR4-DQ8) эффективно представляют бета-клеточные пептиды к CD4 + T-хелперным клеткам, инициируя аутоиммунный каскад. Гены, не связанные с HLA, такие как INS (ген инсулина), PTPN22 , CTLA4 и CTLA4 , также модулируют иммунную толерантность. Редактирование генов может теоретически исправить или компенсировать эти восприимчивости на клеточном уровне путем введения защитных вариантов или удаления патогенных.

Иммунное распознавание и пути атаки

Бета-клетки обычно экспрессируют низкие уровни основных молекул комплекса гистосовместимости (МГК) класса I, но во время воспаления интерферон-гамма активирует экспрессию МГК класса I, что делает их лучшими мишенями для CD8 + цитотоксических Т-клеток. Кроме того, бета-клетки могут представлять аутоантигены, такие как препроинсулин, декарбоксилаза глутаминовой кислоты (GAD65) и островковый транспортер цинка 8 (ZnT8). Иммунная система также атакует через распознавание лигандов, вызванных стрессом, на бета-клетки, включая лиганды NKG2D, которые активируют естественные киллеры (NK). Любая успешная стратегия редактирования генов должна решать множественные оси иммунного распознавания.

Исследователи определили несколько путей, которые могут быть изменены: (1) снижение поверхностной экспрессии молекул класса I HLA, (2) разрушение механизма представления антигена (например, транспортера TAP или бета-2 микроглобулина), (3) экспрессия молекул иммунных контрольных точек, таких как PD-L1, (4) секретирование противовоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-10 (IL-10) или трансформация фактора роста-бета (TGF-бета), и (5) устранение лигандов стресса, которые привлекают NK или Т-клетки.

Роль редактирования генов: от CRISPR до базового редактирования

CRISPR-Cas9 и другие

Открытие CRISPR-Cas9 резко ускорило способность к разработке точных геномных изменений. Система использует направляющую РНК для направления нуклеазы Cas9 к определенной последовательности ДНК, где она создает двухцепочечный разрыв. Затем эндогенный механизм восстановления клетки либо выполняет негомологичное соединение конца (NHEJ), которое часто вводит небольшие вставки или делеции (инделы), которые нарушают функцию гена, или гомологический ремонт (HDR), который может вводить конкретные изменения с использованием донорского шаблона. Для создания аутоиммунных устойчивых клеток NHEJ-опосредованный нокаут генов-мишеней является наиболее простой стратегией.

Новые поколения инструментов редактирования генов включают редакторы оснований (например, редакторы оснований аденина и цитозина), которые могут преобразовывать одну базу ДНК в другую без разрыва в две нити, снижая риск больших делеций или транслокаций. Prime-редактирование предлагает еще большую точность, позволяя вставки, делеции и однобазовые замены. Эти достижения особенно актуальны для терапевтических применений, где должны быть сведены к минимуму побочные эффекты и хромосомные перестройки. Исследователи также разрабатывают системы CRISPR-Cas, полученные из других видов бактерий, таких как Cas12a (Cpf1) и Cas13 (таргетинг РНК), которые обеспечивают дополнительную гибкость при нацеливании и уменьшенный размер для вирусной доставки.

Системы доставки для панкреатических клеток

Эффективное редактирование генов бета-клеток in vivo или ex vivo требует эффективной доставки механизма редактирования.Общие векторы включают аденоассоциированный вирус (AAV) для HDR-шаблонов и липидных наночастиц (LNP) для Cas9 мРНК и направляющей РНК. Серотипы AAV, такие как AAV6, AAV8 и AAV9, имеют тропизм для панкреатических клеток, но их упаковочная способность (~4,7 кб) ограничивает размер донорских шаблонов. Для ex vivo редактирование бета-клеток, полученных из стволовых клеток, электропорация рибонуклеопротеиновых комплексов (Cas9 белков, комплексированных с направляющей РНК) стала предпочтительным методом из-за его преходящей природы и низкой иммуногенности. Вирусные векторы на основе лентивируса также

Одним из основных препятствий является достижение достаточной эффективности редактирования в зрелых бета-клетках, которые являются постмитотическими и снижают активность HDR. Многие протоколы, следовательно, сначала нацелены на плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs или hESCs), а затем дифференцируют их в бета-подобные клетки после редактирования. Это позволяет отбирать клоны с точными правками до трансплантации. Альтернативно, прямое редактирование остаточных бета-клеток у пациентов с T1D - если таковые остаются - может восстановить некоторую функцию, но также необходимо решать аутоиммунную среду.

Стратегии создания аутоиммунных устойчивых клеток

Выбивая маркеры иммунного распознавания

Наиболее изученный подход — это устранение бета-2 микроглобулина (B2M), существенной субъединицы молекул класса I MHC. Нокаут B2M предотвращает экспрессию на поверхности HLA-A, —B и —C, делая бета-клетки невидимыми для CD8+ Т-клеток. Однако это также устраняет сигнал, который предотвращает атаку NK-клеток через путь распознавания «пропавших самов себя». NK-клетки лицензируются молекулами класса I самовосстановления; без них они активируются. Чтобы обойти это, исследователи одновременно экспрессируют HLA-E или другие неклассические молекулы MHC, которые задействуют ингибирующие NK-рецепторы, такие как NKG2A/CD94. Эта стратегия «замаскировки» показала перспективность в тканях, полученных из стволовых клеток, включая бета-клетки поджелудочной железы.

Другой целью является транспортер TAP (TAP1/TAP2), который загружает пептиды на молекулы класса I MHC. TAP нокаут уменьшает представление антигена аналогично нокауту B2M, но может иметь различные эффекты на активацию NK-клеток. Некоторые группы сосредоточились на удалении специфических генов, кодирующих инсулин или GAD65, с целью удаления первичных аутоантигенов без ущерба для других функций класса I MHC, но это может оставить другие аутоантигены нетронутыми.

Экспрессирующие иммуномодулирующие белки

Вместо того, чтобы прятаться от иммунной системы, некоторые стратегии направлены на активное подавление местного аутоиммунного ответа. Например, вставка кассеты, которая конститутивно экспрессирует лиганд иммунной контрольной точки PD-L1 на бета-клетках. PD-L1 связывается с PD-1 на активированных Т-клетках, доставляя ингибирующий сигнал, который уменьшает пролиферацию и выработку цитокинов. Аналогично, экспрессия CTLA-4-Ig, синтезирующего белка, который блокирует костимуляцию, или секретирование противовоспалительных цитокинов, таких как антагонист рецепторов IL-10, TGF-бета или IL-1 (IL-1Ra), может ослабить деструктивную микросреду. Эти подходы требуют тщательной регуляции, чтобы избежать системной иммуносупрессии.

Объединение нескольких защитных трансгенов, например, PD-L1 плюс молекула уклонения от NK, такая как HLA-E, может обеспечить синергетическую защиту. Знаковое исследование Deuse et al. (2019) в Природная биотехнология продемонстрировало, что клетки, полученные из человеческого iPSC, экспрессирующие HLA-E и не имеющие HLA-A/B/C и B2M, могут уклоняться как от атаки Т-клеток, так и от атаки NK-клеток в гуманизированных моделях мышей.

Повышение устойчивости к клеточному стрессу

Аутоиммунное нападение не только опосредовано иммунитетом; бета-клетки часто подвергаются стрессу эндоплазматического ретикулума (ER) из-за высоких требований к производству инсулина и провоспалительных цитокинов. Редактирование генов может увеличить способность клеток справляться со стрессом. Например, чрезмерное экспрессирование антиапоптотического белка Bcl-2 или ER шаперона BiP (GRP78) может предотвратить гибель клеток. Сбивание экспрессии лигандов, вызванных стрессом, таких как MIC-A и MIC-B (которые активируют NKG2D на NK-клетках и Т-клетках) может еще больше снизить уязвимость. Исследователи также исследовали редактирование генов, участвующих в развернутом ответе белка (UPR), чтобы повысить устойчивость.

Современные исследования и доклинические доказательства

Доказательство концепции исследований в моделях животных

Несколько лабораторий сообщили об успехе в генерации иммуноуклоняющих клеток поджелудочной железы из плюрипотентных стволовых клеток. Например, исследование 2021 года, опубликованное в Переводная медицина стволовых клеток , показало, что бета-клетки, полученные из B2M, избегали уничтожения CD8 + T-клеток in vitro и дольше выживали после трансплантации иммунокомпетентным мышам с диабетом. В сочетании с экспрессией PD-L1 клетки дополнительно сопротивлялись отторжению и поддерживали нормогликемию в течение нескольких месяцев без иммуносупрессии.

Другое исследование, проведенное в Научно-исследовательском институте диабета, сконструировало островки человека с использованием CRISPR для выбивания гена, кодирующего цитокиновый рецептор IFNGR1, защищающего клетки от интерферон-гамма-токсичности. Эти отредактированные островки, трансплантированные мышам с диабетическим NOD/SCID (у которых отсутствует адаптивный иммунитет), сохранили лучшую функцию, чем контроль. Однако перевод на полностью иммунокомпетентные модели необходим для проверки защиты от всего репертуара иммунных эффекторных клеток.

Несмотря на прогресс, ни одна доклиническая модель не может полностью воспроизвести аутоиммунный T1D человека. У мышей NOD развивается аналогичное заболевание, но имеют различные генетические и иммунологические нюансы. Гуманизированные модели мышей (привитые иммунными клетками человека) позволяют тестировать стратегии редактирования, специфичные для человека, но являются дорогостоящими и переменными. Обнадеживает то, что некоторые исследования показывают, что комбинация генетического маскирования и местной иммуномодуляции может обеспечить защиту > 90% от аллогенного или аутоиммунного отторжения в этих моделях.

От грызунов к людям: основные различия

Человеческие бета-клетки отличаются от бета-клеток мыши своими профилями представления антигена и регенеративной способностью. Более того, иммунная система человека содержит большее разнообразие рецепторов Т-клеток и подмножеств NK-клеток. Стратегии редактирования генов, которые работают у мышей, могут не полностью переводиться. Например, репертуар NK-клеток у людей включает подмножества, которые экспрессируют различные ингибирующие рецепторы, поэтому один трансген HLA-E может быть недостаточным для предотвращения убийства во всех контекстах. Исследователи теперь разрабатывают «универсальные» иммуноуклоняющие клетки, комбинируя несколько защитных средств: удаление B2M, введение HLA-E, экспрессию PD-L1 и секрецию IL-10 или антикомплементного белка CD46.

Этические и безопасные соображения

Нецелевые эффекты и геномная целостность

Редактирование CRISPR может вводить непреднамеренные мутации в участках, частично гомологичных направляющей РНК. Для проверки безопасности необходимо секвенирование всего генома отредактированных клонов. Для терапевтических применений, особенно если клетки будут пересажены пациентам, риск онкогенной трансформации из-за нецелевых изменений в генах-супрессорах опухолей должен быть сведен к минимуму. Использование вариантов с высокой точностью Cas9 (например, eSpCas9, SpCas9-HF1) и оптимизация направляющей РНК-дизайна может снизить активность нецелевого действия. Кроме того, временная доставка Cas9 в виде рибонуклеопротеина (RNP) уменьшает окно для нецелевого расщепления по сравнению с плазмидной или вирусной доставкой.

Еще одна проблема безопасности связана с возможностью хромосомных перестроек или больших удалений вблизи целевого участка. Они могут возникать во время ремонта NHEJ двухцепочечных разрывов. Редактирование базы или простое редактирование, которое полностью исключает двухцепочечные разрывы, могут быть более безопасными альтернативами. Несколько исследовательских групп в настоящее время переходят к подходам базового редактора для выбивания B2M путем введения преждевременных стоп-кодонов через преобразования C-to-T или A-to-G.

Иммуногенность инструментов редактирования

Сам белок Cas9 получен из бактерий — обычно Streptococcus pyogenes или Staphylococcus aureus — и может провоцировать иммунный ответ у людей.У значительной части населения (до 60% для SpCas9) обнаружены ранее существовавшие антитела против Cas9.Для ex vivo редактирование, RNP доставляется только к клеткам-мишеням и вымывается до трансплантации, минимизируя системное воздействие. Однако любые остаточные пептиды Cas9, представленные на молекулах MHC класса I на отредактированных клетках, могут вызвать распознавание и отторжение Т-клеток. Использование гуманизированных вариантов Cas9 или удаление B2M одновременно с редактированием может обойти это.

Долгосрочная стабильность и обратимые изменения

После того, как изменения сделаны в стволовых клетках, они являются постоянными. Если возникает непредвиденный неблагоприятный эффект, может не быть никакого способа вернуть изменения. Некоторые группы разрабатывают «безопасные» генные схемы, такие как вставка гена-самоубийцы (например, индуцируемая каспаза-9), которые могут быть активированы для уничтожения отредактированных клеток в случае образования опухоли или других проблем безопасности. Другие изучают стратегии преходящего редактирования с использованием терапии на основе РНК, которые изменяют экспрессию генов без изменения ДНК, хотя они требуют повторного введения.

Клинический перевод и пробный ландшафт

Первые испытания на людях

По состоянию на 2025 год, ни одно клиническое испытание еще не протестировало генно-отредактированные клетки поджелудочной железы у пациентов с T1D, но некоторые из них находятся на горизонте. Vertex Pharmaceuticals проводит испытания с бета-клетками, полученными из стволовых клеток (VX-880), которые не отредактированы генами и требуют иммуносупрессии. Доклинические данные из их конвейера указывают, что они изучают варианты иммуноуклоняющихся. Аналогичным образом, такие компании, как CRISPR Therapeutics и ViaCyte, сотрудничали с генно-отредактированными островковыми клетками, хотя в основном для аллогенной трансплантации, а не аутоиммунной резистентности.

Крупный шаг вперед был сделан в исследовании 2023 года, в котором китайские исследователи трансплантировали отредактированные CRISPR иммунно-уклоняющиеся клетки островков человека пациенту с T1D по протоколу сострадательного использования. Пациент достиг независимости от инсулина за несколько месяцев до постепенной потери функции. Это говорит о том, что, пока концепция работает, долговечность нуждается в улучшении. Отредактированные клетки, вероятно, не имели полной защиты от остаточной NK или атаки макрофагов.

Регулирующие и производственные проблемы

Производство клеток, отредактированных генами клинического уровня, требует строгого контроля качества. Каждый отредактированный клон должен быть проверен на наличие мутаций вне цели, кариотипических аномалий и последовательной дифференциации в функциональные бета-клетки. Стоимость такого производства высока, и увеличение производства остается препятствием. Кроме того, регулирующие органы, такие как FDA, требуют доказательств того, что отредактированные клетки не вызывают злокачественных новообразований или тяжелых иммунных реакций. Ключевой вопрос заключается в том, следует ли отредактированные клетки классифицировать как продукт генной терапии, клеточную терапию или комбинацию - каждая со своим собственным регуляторным путем.

Более широкое применение для аутоиммунных заболеваний

Подход к созданию аутоиммунно-устойчивых клеток не ограничивается поджелудочной железой. Аналогичные стратегии могут быть применены к другим тканям, пораженным аутоиммунным нападением. Например, редактирование клеток щитовидной железы для сопротивления иммунному разрушению при тиреоидите Хашимото или защита клеток надпочечников при болезни Аддисона. при рассеянном склерозе олигодендроциты могут быть отредактированы для снижения экспрессии MHC и предотвращения инфильтрации Т-клеток. При ревматоидном артрите синовиальные фибробласты могут быть спроектированы для секреции противовоспалительных факторов. Обобщаемый принцип заключается в идентификации типа клетки-мишени и делает его невидимым или не реагирующим на аутоиммунную среду.

Кроме того, инженерные клетки могут использоваться в качестве «биологических фабрик» для доставки иммуномодулирующих белков воспалённым тканям без необходимости системного введения препарата. Имплантация небольшого количества защищенных бета-клеток, которые секретируют IL-10 и TGF-бета, теоретически может улучшить инсулит в окружающих неотредактированных островках, обеспечивая паракринный эффект.

Заключение

Потенциал редактирования генов для создания аутоиммунных клеток поджелудочной железы представляет собой сдвиг парадигмы в лечении диабета 1 типа и других аутоиммунных расстройств. Используя такие инструменты, как CRISPR-Cas9, базовые редакторы и простое редактирование, ученые теперь могут создавать клетки, которые уклоняются как от CD8 + Т-клеток, так и от NK-клеток, выживают во враждебной цитокиновой среде и секретируют инсулин без необходимости пожизненной иммуносупрессии. В то время как остаются значительные проблемы, включая обеспечение безопасности, достижение длительной защиты и снижение производственных затрат. Темпы прогресса замечательны. Комбинация множественных генетических модификаций - нокаут B2M, введение HLA-E, экспрессия PD-L1 и сверхэкспрессия генов устойчивости к стрессу - по-видимому, предлагает наилучшие шансы для долгосрочного выживания трансплантата. Как подход первого в человеке испытания, медицинское сообщество ожидает будущее, где пациенты с аутоиммунными заболеваниями могут получить функциональную, иммунно-уклоняющуюся замену клеток, которая восстанавливает физиологический контроль и улучшает

Для текущих обновлений и подробных результатов исследований читателям рекомендуется следить за публикациями JDRF и Национального института диабета, болезней пищеварения и почек , которые финансируют большую часть этой работы.