Table of Contents

Сахарный диабет остается одной из самых насущных глобальных проблем здравоохранения, затрагивающей более 500 миллионов взрослых и налагающей тяжелое бремя на системы здравоохранения во всем мире. Болезнь характеризуется хронической гипергликемией, вызванной дефектами секреции инсулина, действия инсулина или и того, и другого. В то время как современные диагностические критерии основаны в первую очередь на уровнях глюкозы в крови и гликированного гемоглобина (HbA]1c), эти меры часто обнаруживают заболевание только после того, как произошло значительное метаболическое повреждение. Существует настоятельная необходимость в более чувствительных, специфических и ранних биомаркерах, которые могут предсказать начало, контролировать прогрессирование и направлять персонализированную терапию. Протеомное профилирование - крупномасштабный анализ белкового дополнения биологической системы - появилось как мощный инструмент для обнаружения таких биомаркеров. Изучая динамические и функциональные молекулы, которые непосредственно влияют на клеточное поведение, протеомика предлагает окно в молекулярную патологию диабета, которую не может обеспечить только геномика. Эта статья исследует, как протеомное профилирование применяется для выявления новых биомаркеров диабета

Что такое протеомное профилирование?

Протеомное профилирование включает в себя комплексную идентификацию и количественную оценку белков, экспрессируемых в клетке, ткани или организме в определенных условиях. В отличие от статического генома, протеом является высокодинамичным, отражающим клеточные состояния в реальном времени, на которые влияют генетика, окружающая среда, образ жизни и болезни. Белки являются основными эффекторами биологической функции - они катализируют реакции, преобразуют сигналы, формируют структурные каркасы и опосредуют иммунные ответы. Поэтому непосредственное измерение уровней белка и посттрансляционных модификаций дает представление о механизмах заболевания, которые ближе к фенотипу, чем геномные маркеры.

Современные протеомные рабочие процессы обычно включают три основных этапа: подготовка образца (экстракция, пищеварение и фракционирование), разделение и обнаружение (часто с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии, LC-MS / MS) и анализ данных (идентификация пептидов, количественная и статистическая интерпретация). Достижения в масс-спектрометрах высокого разрешения, таких как инструменты Orbitrap и Q-TOF, теперь позволяют исследователям регулярно количественно оценивать тысячи белков из одного образца крови или ткани. В дополнение к масс-спектрометрии, методы на основе аффинности, такие как микрочипы антител, SOMAscan на основе аптамера и анализы расширения близости предлагают дополнительные подходы для целевого и нецелевого измерения белка.

Масс-спектрометрия на основе протеомики

Масс-спектрометрия остается рабочей лошадкой беспристрастного протеомного открытия. При типичном подходе «снизу вверх» белки ферментативно перевариваются в пептиды, разделяются жидкой хроматографией и вводятся в масс-спектрометр. Инструмент измеряет соотношение массы к заряду пептидов и их фрагментов для определения их последовательности. Сопоставляя эти спектры с белковыми базами данных, исследователи могут идентифицировать и количественно оценить тысячи белков в одном прогоне. Количественное определение может быть достигнуто с помощью методов без меток (на основе спектральных показателей или интенсивности ионов) или с использованием стабильных методов маркировки изотопов, таких как TMT (метки тандемной массы) или SILAC (стабильная маркировка изотопов аминокислотами в клеточной культуре). Для исследований биомаркеров диабета были проанализированы плазма, сыворотка, моча, ткань поджелудочной железы и даже экзосомы для идентификации дифференциально экспрессируемых белков.

Белковые микрочипы и методы аффинности

В то время как масс-спектрометрия превосходит открытие, целевые подходы часто необходимы для валидации и клинического перевода. Белковые микрочипы могут одновременно обнаруживать сотни предварительно определенных белков с использованием иммобилизованных антител или других связующих. Анализ SOMAscan, в котором используются модифицированные аптамеры (SOMAmers) для связывания белков с высокой специфичностью, может измерять до 7000 белков из небольшого объема выборки. Аналогично, анализы расширения близости (PEA) сочетают связывание антител с гибридизацией ДНК и количественной ПЦР для достижения высокой чувствительности и мультиплексирования. Эти технологии все чаще используются в крупных когортных исследованиях для быстрого скрининга потенциальных биомаркеров диабета.

Патофизиология диабета и потребность в биомаркерах

Диабет — это не одно заболевание, а спектр метаболических нарушений. Две наиболее распространенные формы — диабет 1 типа (T1D), аутоиммунное состояние, приводящее к разрушению бета-клеток и абсолютному дефициту инсулина, и диабет 2 типа (T2D), который включает прогрессирующую резистентность к инсулину и относительный дефицит инсулина. Дополнительные формы включают гестационный диабет, моногенный диабет и вторичный диабет из-за других условий. Каждый подтип имеет четкую этиологию и требует индивидуальных стратегий управления.

Современные клинические биомаркеры диабета — глюкоза в плазме, 2-часовой тест на толерантность к глюкозе (OGTT) глюкозы и HbA1c — эффективны для диагностики установленной гипергликемии, но имеют заметные ограничения. На них могут влиять такие факторы, как возраст, раса, анемия и гемоглобинопатии. Кроме того, эти маркеры дают мало информации о базовых патофизиологических процессах, таких как дисфункция бета-клеток, резистентность к инсулину, воспаление или аутоиммунитет. Существует насущная потребность в биомаркерах, которые могут: (1) идентифицировать людей с высоким риском до развития гипергликемии, (2) различать подтипы диабета, (3) прогнозировать прогрессирование заболевания и осложнения и (4) направлять выбор оптимальных методов лечения. Протеомное профилирование хорошо расположено для устранения этих пробелов, выявляя белковые сигнатуры ранней метаболической дисрегуляции.

Тип 1 против диабета 2 типа: отличительные протеомные признаки

Протеомные исследования начали выявлять различия в плазменном протеоме пациентов с T1D и T2D. Например, у лиц с T1D часто проявляются повышенные белки, связанные с аутоантителами, и маркеры иммунной активации, такие как индуцированный интерфероном белок 10 (IP-10) и другие хемокины. В T2D протеомный профиль имеет тенденцию отражать дисфункцию жировой ткани, хроническое воспаление низкой степени и измененный липидный обмен. Белки, такие как адипонектин, лептин, резистин и ретинол-связывающий белок 4 (RBP4), были связаны с резистентностью к инсулину. Профилируя эти различные закономерности, протеомика может помочь в точной классификации, особенно в неоднозначных случаях, таких как латентный аутоиммунный диабет у взрослых (LADA).

Ключевые протеомные открытия при диабете

За последнее десятилетие многочисленные исследования использовали протеомное профилирование для выявления новых биомаркеров диабета. Эти открытия охватывают медиаторы воспаления, белки, участвующие в метаболизме глюкозы и липидов, маркеры бета-клеточного стресса и компоненты систем комплемента и коагуляции. Ниже мы выделяем некоторые из наиболее перспективных кандидатов и идеи, которые они предоставляют в биологии заболеваний.

Воспалительные белки и инсулинорезистентность

В настоящее время хорошо известно, что хроническое воспаление является как причиной, так и следствием резистентности к инсулину. Протеомные анализы выявили множество воспалительных белков, которые последовательно повышаются в циркуляции резистентных к инсулину людей и пациентов с T2D. Например, C-реактивный белок (CRP), интерлейкин-6 (IL-6), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α) и ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1) обычно регулируются. Совсем недавно протеомика выявила дополнительные игроки, такие как галектин-3, который способствует активации макрофагов и фиброзу, и хемерин, адипокин, который модулирует передачу сигналов инсулина. Исследование, использующее протеомику на основе аптамера в исследовании сердца Фрамингема, показало, что белки, участвующие в каскаде комплемента и коагуляции, такие как комплемент C3 и фактор H, были связаны с инцидентом T2D. Эти результаты подчеркивают многогранную роль воспаления в диабете и обеспечивают потенциальные цели для раннего вмешательства.

Белки в метаболизме глюкозы и функции бета-клеток

Протеомное профилирование островков поджелудочной железы и линий бета-клеток пролило свет на молекулярные механизмы дисфункции бета-клеток. Широко охарактеризованы ферменты, участвующие в зондировании глюкозы (например, глюкокиназа), обработке инсулина (проинсулин, С-пептид и конвертазы, такие как PC1/3 и PC2), и секреторные механизмы (например, белки SNARE). В T2D наблюдаются сниженная экспрессия ключевых факторов транскрипции бета-клеток и повышенные маркеры стресса окислительного стресса и эндоплазматического ретикулума (ER). Уровни плазмы С-пептида и проинсулина используются клинически, но протеомика выявила дополнительные фрагменты и модифицированные формы, которые могут улучшить диагностическую точность. Например, де-31,32-проинсулин и другие промежуточные проинсулиновые расщепления могут указывать на дефекты обработки бета-клеток. Кроме того, белки, такие как островковый амилоидный полипептид (

Новые кандидаты от последних исследований

Крупномасштабные протеомные исследования в когортах на основе популяции выявили несколько новых биомаркеров, которые требуют дальнейшего исследования. Протеомный анализ более 4000 белков в исследовании риска атеросклероза в сообществах (ARIC) в 2023 году выявил группу из 20 белков, которые улучшили прогнозирование T2D за пределами традиционных факторов риска. Среди них были ангиопойетин-подобные 8 (ANGPTL8), адипокин, который регулирует метаболизм триглицеридов; фоллистатин, который модулирует передачу сигналов активина; и лейкоцитарный хемотаксин 2 (LECT2), связанный с резистентностью к инсулину печени. Другое исследование в когорте KORA использовало профилирование SOMAscan для идентификации 33 белков, связанных с будущим T2D, включая инсулиноподобный фактор роста-связывающий белок 2 (IGFBP-2), который имел защитный эффект. Эти результаты подчеркивают силу непредвзятых протеомных экранов для обнаружения неожиданных биологических связей.

Для дальнейшего чтения обзор эндокринологии природы по протеомике при диабете предоставляет всеобъемлющий обзор, а статья по протеомному профилированию в исследованиях диабета детализирует конкретные исследования.

Проблемы в протеомном профилировании для открытия биомаркеров

Несмотря на свои обещания, перевод протеомных открытий в клинически эффективны биомаркеры сталкивается со значительными препятствиями. Эти проблемы охватывают доаналитические переменные, техническую изменчивость, сложность данных и строгую проверку, необходимую для клинического развертывания.

Преданалитическая изменчивость

Протеом крови очень динамичен и зависит от состояния голодания, времени суток, физических упражнений, лекарств и обработки образцов (например, тип трубки для сбора, скорость центрифугирования, температура хранения). Например, белки плазмы, такие как факторы комплемента, могут быстро разрушаться, если образцы не обрабатываются быстро. Стандартизация преданалитических процедур имеет решающее значение, но затруднена в многоцентровых исследованиях. Использование ингибиторов протеазы и строгих протоколов для сбора и обработки крови может смягчить некоторые из этих проблем, но изменчивость остается значительным источником ложных открытий.

Сложность данных и воспроизводимость

Огромный динамический диапазон протеома плазмы, охватывающий более десяти порядков величины, представляет собой серьезную техническую проблему. Высокое изобилие белков, таких как альбумин и иммуноглобулины, может маскировать биомаркеры с более низким изобилием, что требует этапов истощения или фракционирования, которые могут вводить смещения. Кроме того, идентификация пептидов в масс-спектрометрии по своей сути является стохастической; недостающие значения для белков с низким изобилием усложняют статистический анализ. Хотя количественная оценка без меток является экономически эффективной, она часто имеет более низкую точность, чем методы изотопной маркировки. Воспроизводимость в лабораториях и приборных платформах остается проблемой, побуждая такие инициативы, как Консорциум клинического протеомного опухолевого анализа (CPTAC), чтобы установить лучшие практики.

Валидация и клинический перевод

Кандидат на биомаркер должен быть подтвержден в независимых, крупномасштабных когортах, которые отражают целевую популяцию. Многие перспективные протеомные маркеры не могут быть воспроизведены из-за переобучения в небольших наборах открытий или потому, что первоначально сообщенные размеры эффектов завышены. Перспективные исследования с четко определенными клиническими конечными точками необходимы. Кроме того, для принятия биомаркера в клинической практике он должен добавить ценность за пределы существующих инструментов (например, HbA ]1c , глюкоза) с точки зрения прогнозирования риска, диагностики или терапевтического руководства. Стоимость, воспроизводимость анализа и одобрение регулирующих органов являются дополнительными барьерами. Американская диабетическая ассоциация регулярно оценивает новые биомаркеры и еще не одобрила какой-либо протеомный маркер для рутинного клинического использования.

Будущие направления: интеграция омики и искусственного интеллекта

Следующая волна прогресса в открытии биомаркеров диабета, вероятно, будет связана с интеграцией протеомных данных с другими слоями омики (геномика, транскриптомика, метаболомика, липидомика) и использованием передовых вычислительных методов, таких как машинное обучение. Эти подходы могут захватывать сложные, нелинейные взаимодействия, которые управляют патофизиологией диабета.

Многоомичная интеграция

Каждая технология омик обеспечивает частичное представление о заболевании. Геномика идентифицирует наследственные варианты риска, транскриптомика отражает изменения экспрессии генов, метаболомика захватывает промежуточные молекулы малых молекул и протеомика непосредственно измеряет функциональные эффекторы. Объединив эти наборы данных, исследователи могут картировать причинные пути от генетической восприимчивости к проявлению заболевания. Например, исследование, интегрирующее данные исследования геномной ассоциации (GWAS) с протеомическими данными плазмы от тысяч людей, идентифицированных генами риска диабета, которые связывают гены риска диабета с конкретными белками. Этот подход может расставить приоритеты терапевтических мишеней и выявить, являются ли изменения белка причинными или просто реактивными. Национальный институт диабета и болезней пищеварения и почек (NIDDK) поддерживает несколько крупных инициатив по мультиомике для ускорения этой работы.

Машинное обучение для панелей биомаркеров

Учитывая высокую размерность протеомных данных — часто тысячи особенностей — алгоритмы машинного обучения необходимы для выявления надежных панелей биомаркеров. Такие методы, как случайные леса, машины опорных векторов и нейронные сети, могут обрабатывать взаимодействия и нелинейные отношения. Однако для предотвращения переобучения необходима осторожность. Такие стратегии, как вложенная перекрестная валидация, независимые когорты тестов и тестирование на перестановку, являются стандартными. Некоторые исследования уже продемонстрировали, что объединение 10-20 белков с клиническими переменными значительно улучшает прогнозирование начала T2D по сравнению с клиническими переменными. Поскольку протеомные технологии становятся дешевле и более масштабируемыми, такие многомаркерные панели могут в конечном итоге быть развернуты в рутинном скрининге риска.

Крупномасштабные перспективные исследования

Для подтверждения этих выводов критически важны крупные перспективные когортные исследования, собирающие биопробы до начала диабета. Такие исследования, как исследование UK Biobank (с протеомными данными более 50 000 участников), исследование FinnGen и Консорциум биомаркеров хронической болезни почек (CKD), генерируют ценные ресурсы. Эти наборы данных позволяют исследователям проверить, могут ли уровни белка, измеренные за годы до постановки диагноза, предсказать будущий диабет. Ранние результаты многообещающие: несколько исследований с использованием протеомных данных UK Biobank выявили панели, которые предсказывают T2D с областями под кривой (AUC), превышающими 0,85. Область движется к парадигме точной медицины, где протеомный профиль человека в сочетании с клиническими и генетическими данными информирует о персонализированных стратегиях профилактики и лечения.

Заключение

Протеомное профилирование трансформирует открытие биомаркеров диабета, обеспечивая прямое и функциональное считывание процесса заболевания. От выявления воспалительных медиаторов резистентности к инсулину до характеристики белков стресса бета-клеток, протеомика уже раскопала множество потенциальных биомаркеров, которые углубляют наше понимание патофизиологии диабета. В то время как проблемы в стандартизации, валидации и клиническом переводе сохраняются, интеграция протеомики с другими омическими препаратами и применение машинного обучения ускоряют прогресс. По мере того, как высокопроизводительные протеомные технологии становятся более доступными и воспроизводимыми, есть оптимизм, что протеомные биомаркеры вскоре дополнят традиционные гликемические меры, чтобы обеспечить более раннее выявление, лучшую стратификацию риска и более персонализированное управление диабетом. Для клиницистов и исследователей, ведение в курсе этих событий необходимо, чтобы использовать весь потенциал протеомики в борьбе с этим разрушительным заболеванием.