导 言:基因编辑作为岛细胞保护的新边疆

基因编辑技术的出现从根本上改变了生物医学研究的格局,提供了精确的工具来改写活细胞的基因密码。对于糖尿病患者来说,胰岛细胞的丧失或功能障碍 — — 体内胰岛素生产工厂 — — 可能使这些技术成为疾病的核心。 岛屿细胞移植长期以来是一个治疗选择,但其广泛应用受到捐赠者稀缺、免疫排斥和逐渐丧失遗传功能的限制。基因编辑提供了通过直接修改 Islet细胞来克服这些障碍的潜在途径,使其更具弹性、对免疫系统不太能见并能够再生。最终目标是创造一个胰岛细胞的持久来源,从而可以恢复蛋白血,而无需终生免疫抑制或外生胰岛素。 本条探讨了使用基因编辑来改善细胞生存的科学基础、当前战略、挑战和未来前景。

岛细胞在葡萄糖胡莫斯塔斯的关键作用

兰格汉斯的地峡是分散在胰腺中的微生物,只占胰腺总质的1–2%。 但是,它们对于代谢控制是必不可少的。 在每一个地峡中,有五个主要的细胞类型在协同作用:β细胞(胰岛素)、α细胞(克卢卡贡)、三角细胞(血红蛋白)、PP细胞(多肽)和epsiron细胞(克勒林 ) 。 其中,β细胞是最受研究的,因为胰岛素是导致血糖降低的主要激素。 在健康个体中,β细胞感知葡萄糖水平的波动,以及因此隐秘的胰岛素。

第1型糖尿病:自动销毁

在1型糖尿病(T1D)中,由自反应T淋巴细胞所驱动的自体免疫攻击特别针对并摧毁了β细胞。 这一过程通常在临床诊断前数年就开始,到症状出现时,大多数β细胞已经消灭。 患者必须依靠外出胰岛素注射或泵疗法维持生命,然而即使经过了密集管理,甘油控制也并不完善,导致长期并发症,如肾上腺病、肾上腺病、神经病和心血管病。

第2型糖尿病:功能下降和元素应激

2型糖尿病(T2D)的特点是胰岛素抗药性,同时伴有渐进的β细胞功能障碍. 随着时间的推移,长期接触高血糖症,自由脂肪酸升高,以及炎症细胞会给叶酸细胞带来严重的代谢压力,这导致氧化性应激,内质还原性应激,并最终导致人口死亡。 尽管生活方式的改变和药物可以减缓进展,但许多T2D患者最终需要胰岛素疗法作为β细胞质和功能弱素。 因此,增强叶酸细胞存活率既能使T1D人群受益,也能使T2D人群受益。

基因编辑技术:精密修改工具包

基因编辑是指基因组内DNA序列的定向修改。 已经开发出多个平台,每个平台都有独特的优点和局限性。 被最广泛采用的是CRISPR-Cas9,它们来自细菌适应性免疫系统。 CRISPR使用指南RNA引导Cas9核子释放到特定的DNA序列,从而产生双弦断裂。 然后细胞自身的修复机械要么通过非同源端结合(NHEJ)引入小的插入或删除(indels),经常会干扰基因,要么在提供捐赠模板时,通过同源性导向修复(HDR)引导引入精确的编辑(HDR ) 。

除了Cas9, Cas12a(Cpf1)和Cas13(目标RNA)等较新的变体,扩展了工具箱. Base编辑是一种衍生技术,允许将一核苷酸直接转换为另一核苷酸(如C-T或A-G)而不需要双弦断裂,从而降低了意外突变的风险. Prime编辑更进一步,通过允许搜索和替换编辑可长达数十个碱基对,这些进步对于 Islet工程特别相关,因为它们在修改拟用于临床移植的细胞时提供了更高的精度和安全性——对于临床移植来说至关重要.

旧的工具,如锌指核释放和复制活性作用器-类似效应核释放(TALENs)仍在使用,但CRISPR的设计和多功能的便利使其成为了主导平台。 对于岛屿研究,CRISPR被运用来击倒那些使β细胞易受免疫攻击或压力的基因,敲击保护基因并激活内生修复路径。

岛式牢房的交付方法

将基因编辑组件送入初级岛细胞是一个重大技术障碍。 内源性岛是难以有效转录的多细胞群。病毒载体——特别是与异异构病毒(AAV)和异构病毒——被普遍使用,但它们有局限性:AAV的包装容量有限(~4.7克b),而且可能无法实现集束内所有细胞的统一编辑。伦蒂病毒可以融入基因组,引起对插入突变的担忧。脂质纳米粒子、电波和细胞穿孔性肽等非病毒方法正在积极调查中。有些群体已经制定了将Cas9 riboncleoprotein(RNP)复合体直接送入岛细胞的方法,实现了高编辑效率,并降低了离目标效应。 投放系统必须平衡效率、安全性和可扩展性,最终临床使用。

改善岛细胞生存的战略方法

研究人员正在推行几种不同但互补的基因编辑策略,以保护被隔离的细胞免受糖尿病中面临的侮辱。 这些策略可以大致分为免疫逃避、抗压力和再生。

免疫性外逃

保护被移植的岛细胞最直接的方法之一是使其对免疫系统隐去。 主要的同位素复合体I类分子(MHC)呈现出可触发T细胞识别的抗原。 通过敲出基因编码β-2微血球素(B2M),作为MHC类I的必要组成部分,研究人员产生了无法向CD8+细胞T呈现抗原的岛细胞。 然而,缺失的MHC类I可以通过“缺失自体”反应激活自然杀手(NK)细胞。 为了应对这种情况,细胞可以被工程化来表达抑制NK细胞的韧带,如HLA-E或非古典MHC分子。

另一种免疫逃避策略是表达免疫抑制蛋白,从而抑制免疫反应。 比如,在岛细胞上检查分子PD-L1的转基因表达可以在活化的T细胞上使PD-1受体发生活化,诱发疲劳或厌倦. 类似地,CTLA-4-Ig或IL-10的分泌可以形成一种过敏的微观环境。 在临床前模型中,这些改变即使没有系统性免疫抑制,也延长了遗传存活期。

抗压力

岛细胞尤其容易受到氧化应激反应的影响,因为它们表现出低水平的内生抗氧化酶,如超氧化脱氧酶(SOD)、催化酶和过氧化物。 基因编辑可以促进这些防御。 例如,以核要素红外线2相关因子(NRF2)为主调节器敲击,可以保护β细胞免受体外氧化损伤。 肝炎氧酶-1(HO-1)或硫代红素的过度表达也具有抵抗刺激细胞皮和低氧损伤的能力。

此外,ER应激在β细胞功能障碍中起主要作用。 无法被覆盖的蛋白质反应(UPR)途径可以被调制以提高细胞存活率。 XBP1,ATF4 等基因的编辑可能会将平衡从活性化向适应化倾斜。 但是,必须注意不要损害正常的蛋白质折叠或诱导肿瘤转化。

复兴与扩散

保护现有细胞的一种替代方法是从存活的岛细胞或其他类型的细胞中刺激新β细胞再生. 基因编辑可以用于激活对β细胞发育和功能至关重要的转录因子,如PDX1,MAFA,和NKX6.1. 例如,PDX1在非β细胞(如α细胞或胰腺管细胞)中的异位表达可以驱动异位分化为胰岛素生成细胞. 在活体中,CRISPR通过介导,使用被转录活体所熔化的dCas9来激活内生PDX1,在鼠标模型中已经得到证明.

另一种方法是将细胞循环调节器作为诱导现有β细胞扩散的目标。 循环D1、CDK4和WNT信号组件等基因被操纵,以加强复制。 然而,不受控制的扩散带有肿瘤形成的风险,因此临床翻译需要不可导出或可逆的系统。 研究人员正在探索“自杀开关”或药物控制系统,以在必要时阻止扩散。

目前的研究和临床进展

越来越多的临床前工作支持了基因编辑对岛地保护的可行性。 在2019年,一份在Nature 上发表的划时代研究显示,CRISPR编辑的猪笼草缺乏三种主要的异抗原(GGTA1,CMAH,B4GALNT2),在移植到非人类灵长类动物时存活的时间更长。 尽管这涉及到异抗糖分泌,但原理直接适用于人类岛地。 最近在旧金山加州大学的研究人员使用基础编辑在Fas基因中引入了一种无谓的人类β细胞突变,使其对Fas ligand died apotosis病具有抗性。 这些细胞维持了糖反应的胰岛分泌,在糖尿病小鼠中存活的时间更长。

在T1D领域,ViaCyte(现为Vertex Pharmaces)已经推出了干细胞衍生的异叶质替代产品(PEC-Encap),该产品使用宏观封装装置保护细胞免受免疫攻击。虽然没有基因编辑,但这种方法突出了免疫保护的必要性。 将封装与基因编辑结合起来以表达局部免疫机能是合乎逻辑的下一步。 几个学术团体正在研究“普遍捐赠”干细胞线,其中MHC一级和二级基因被干扰并被插入保护性转基因。 多元干细胞衍生出β细胞(SC-β细胞)的早期结果表明,这种编辑能够改善所有遗传障碍中的生存。

临床试验中专门针对通过基因编辑实现异体细胞存活的实验尚未开始,但相关的编辑免疫细胞(如CAR-T细胞)试验提供了一个监管和安全的先例。 2016年,首次使用CRISPR编辑的体细胞的人体试验(NCT02793856)针对肺癌,此后积累的安全数据支持了可移植细胞的外活性编辑的可行性。 对于异体,最有可能进入诊所的路径是在移植前对捐献体或干细胞衍生的同体进行外活性改造,随后对非目标效应和长期安全进行严格监测。

挑战和路障

尽管有这一承诺,但在基因编辑的岛细胞成为标准疗法之前,必须解决若干重大挑战。

目标外效应和摩赛主义

基因组学研究(CRISPR-Cas9)可以无意中在基因组学上切入与预定目标序列相似的基因组学场点,导致出乎意料地突变。 虽然生物信息学工具和改进的Cas9变体(如高真能SpCas9)降低了非目标率,但它们并没有完全消除。 在必须同时对许多细胞进行编辑的地盘集群中,摩赛克主义的风险 — — 有些细胞经过了编辑,而另一些则没有进行 — — 可能损害整体保护效果。 编辑效率必须足够高,以确保功能效益,但不会过于激进而损害细胞生存能力。

交付和可扩展性

将基因编辑试剂送入人的主要岛与细胞线相比仍然效率低下。 岛的三维结构,细胞外基质密集,细胞核心难以进入,阻碍了统一的编辑。电压可以实现高效,但往往会降低可行性。病毒载体只能转录出表面细胞。对于临床用途、可伸缩和可再生的制造过程,必须开发这种系统。 这对干细胞衍生的岛来说尤其具有挑战性,因为干细胞衍生的岛要求制定已经具有可变效率的分化协议。

道德和监管考虑

基因编辑体细胞(如小岛)在道德上一般被认为是可以接受的,因为修改不能遗传。 但是,对于非目标效应、长期安全以及肿瘤发作可能性的担忧需要严格的监督。 食品药品管理局和EMA等监管机构已经发布了关于细胞基因治疗产品的指导方针,但基因编辑体细胞的具体指导仍在演变中。 基因编辑体编辑与应用无关,但公众的认知仍是一个因素。 关于风险收益比率的透明沟通至关重要。

T 单元格以外的杂质

反T细胞的免疫性逃生策略可能无法保护抗原免疫成分,如宏发素、中微分泌素等。 外接物移植引发血管内移植即时血液介质炎症反应(IBMIR),导致迅速破坏。 基因编辑以表达对Ilt细胞表面的调控蛋白(如CD46、CD55、CD59)的补充,但全面的保护可能需要多次同步编辑。 此外,移植接受者的免疫系统可能会通过替代途径演化,以识别经编辑的细胞,从而需要综合疗法。

未来展望:建立糖尿病功能库

基因编辑、干细胞生物学和材料科学的融合为糖尿病的功能治疗提供了一条现实的道路。 近期(5-10年),我们有可能看到人类胚胎干细胞或诱发多能干细胞产生的前活性基因编辑小岛的临床试验。 这些细胞将因免疫逃避和抗应力而被工程所设计,然后被封入一种生物相容的装置,允许营养交流,同时防止免疫细胞接触。 这种产品可以提供长期的胰岛素独立,而不会免疫抑制。

长期而言,在活性基因编辑中,可能利用病毒载体或脂质纳米粒子将内生胰细胞(如α细胞或阴道细胞)直接重新编程为β细胞,从而完全消除了移植的必要性。在2022年发表的Cell Stem Cell[中的一项概念证明研究表明,将基于CRISPR的活性细胞静脉注射给糖尿病小鼠的PDX1基因,导致β细胞质量部分恢复并实现血糖正常化。 对人类的翻译面临重大障碍——交付的特性、效率和安全——现在确立了这一原则。

个性化医学也会起一定的作用. 具有特定基因背景的患者可能受益于特制编辑. 例如,在HNF1A[或GCK中因突变而导致一源性糖尿病(MODY)的个人理论上可以通过基因编辑和再植来纠正自己的β细胞. CRISPR的诊断和治疗方法的结合,可以在未来进行同日诊断和治疗.

学术中心、生物技术公司和监管机构之间的合作对于加速进步至关重要。 包括JDRF和美国糖尿病协会等组织在内的1型糖尿病研究界已经将基因编辑确定为优先领域。 随着持续投资和认真的科学,通过编辑的岛细胞恢复天然胰岛素生产的长期目标可能很快成为临床现实。